Page 135 - 《广西植物》2025年第7期

７ 期 刘文珍等: 地钱 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因克隆及基因敲除突变体构建 １ ３ ２ ７

序列ꎬ其 Ｌｏｃｕｓ 号为 Ｍｐ１ｇ２９１２０ꎬ命名为 ＭｐＰＰ２Ａ￣ Ａ 序列进行氨基酸比对ꎬ结果显示这 ４ 条氨基酸序
Ａꎮ 另外ꎬ我们利用 ＤＮＡＭＡＮ 序列分析工具ꎬ将拟 列之间的相似度高达 ９１.６２％( 图 １)ꎬ表明其功能
南芥中的 ３ 条 ＡｔＰＰ２Ａ￣Ａ 序列与地钱中的 ＭｐＰＰ２Ａ￣ 在进化上具有一定的保守性ꎮ

图 １ 拟南芥与地钱中 ＰＰ２Ａ￣Ａ 氨基酸序列比对
Ｆｉｇ. １ ＰＰ２Ａ￣Ａ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ａｎｄ Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ

为了获得地钱中 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因的编码序列ꎬ 体 ｐＥＮＴＲ 上ꎬ通过 ＰＣＲ 鉴定并对阳性重组质粒进
本研究首先提取了 ２０ ｄ 左右的地钱总 ＲＮＡ(图 ２: 行测 序ꎮ 结 果 显 示ꎬ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基 因 编 码 区 全 长
Ａ)ꎬ并进行了逆转录ꎬ获得了地钱的 ｃＤＮＡꎮ 随后ꎬ １ ７６１ ｂｐꎬ编码 ５８６ 个氨基酸ꎬ与预期相符ꎬ确认该
基于 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因的已知序列信息ꎬ 设计了其 片段为 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因的完整编码序列ꎮ

ＣＤＳ 上下游引物 ＭｐＰＰ２Ａ￣ＣＤＳ￣Ｆ/ ＭｐＰＰ２Ａ￣ＣＤＳ￣Ｒꎮ ２.２ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋白的生物信息学分析
以地钱的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ通过 ＰＣＲ 扩增ꎬ获得了与 ２. ２. １ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋 白 的 一 级 结 构 使 用
预期大小相符的 ＤＮＡ 片段(图 ２:Ｂ)ꎮ 利用无缝连 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在线分析 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋白的一级结构ꎬ
接技术ꎬ我们将该目的 ＤＮＡ 片段成功连接到克隆载 其分子 式 为 Ｃ ２９０７ Ｈ ４６９１ Ｎ ７７３ Ｏ ８５２ Ｓ ꎻ 等 电 点 ( ｐＩ) 为
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