Page 137 - 《广西植物》2025年第7期
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７ 期 刘文珍等: 地钱 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因克隆及基因敲除突变体构建 １ ３ ２ ９
表 ２ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 蛋白的氨基酸组成
Ｔａｂｌｅ ２ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ
氨基酸 数量 比例 氨基酸 数量 比例
Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ (％) Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ (％)
丙氨酸 Ａｌａ (Ａ) ５４ ９.２ 赖氨酸 Ｌｙｓ (Ｋ) ２５ ４.３
精氨酸 Ａｒｇ (Ｒ) ３１ ５.３ 甲硫氨酸 Ｍｅｔ (Ｍ) ２０ ３.４
天冬酰胺 Ａｓｎ (Ｎ) ２１ ３.６ 苯丙氨酸 Ｐｈｅ (Ｆ) １８ ３.１
天冬氨酸 Ａｓｐ (Ｄ) ４１ ７.０ 脯氨酸 Ｐｒｏ (Ｐ) ３１ ５.３
半胱氨酸 Ｃｙｓ (Ｃ) １４ ２.４ 丝氨酸 Ｓｅｒ (Ｓ) ３１ ５.３
谷氨酰胺 Ｇｌｎ (Ｑ) ２２ ３.８ 苏氨酸 Ｔｈｒ (Ｔ) ２１ ３.６
谷氨酸 Ｇｌｕ (Ｅ) ３９ ６.７ 色氨酸 Ｔｒｐ (Ｗ) ６ １.０
甘氨酸 Ｇｌｙ (Ｇ) ２４ ４.１ 酪氨酸 Ｔｙｒ (Ｙ) １０ １.７
组氨酸 Ｈｉｓ (Ｈ) １０ １.７ 缬氨酸 Ｖａｌ (Ｖ) ５２ ８.９
异亮氨酸 Ｉｌｅ (Ｉ) ４１ ７.０ 吡咯赖氨酸 Ｐｙｌ (Ｏ) ０ ０.０
亮氨酸 Ｌｅｕ (Ｌ) ７５ １２.８ 硒半胱氨酸 Ｓｅｃ (Ｕ) ０ ０.０
杆菌感受态细胞中挑取单克隆测序ꎬ序列正确ꎬ
ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 敲除载体构建成功ꎮ
２.４.２ 农杆菌转化结果及突变体的获得 将构建
成功的敲除载体转入农杆菌中ꎮ 接着对地钱叶状
体在全光照条件下培养 ３ ｄꎬ随后与活化后的农杆
菌共培养 ３ ｄ(图 １０:Ａ)ꎮ
经过筛选和培养后ꎬ利用 ＣＴＡＢ 法分别提取 １３
株转基因地钱的 ＤＮＡꎬ并采用引物 Ｃａｓ９￣Ｆ/ Ｃａｓ９￣Ｒ
进行 ＰＣＲ 检测ꎮ 琼脂糖凝胶电泳的结果(图 １０:Ｂ)
显示ꎬ在预期的 ４５０ ｂｐ 片段处有单一明亮条带ꎬ这
表明携带 Ｃａｓ９ 的表达载体已成功转入地钱中ꎮ 随
图 ３ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 的亲疏水性 后ꎬ 使 用 引 物 ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣１２￣ｊｃ￣Ｆ/ ＭｐＰＰ２Ａ￣
ｃｒｉｓｐｒ￣１２￣ｊｃ￣Ｒ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ并对扩增产物进行测
Ｆｉｇ. ３ Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ
序ꎮ 测序结果(图 １０:Ｃ)显示ꎬ３ 个转基因株系的靶
ｏｆ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ ｐｒｏｔｅｉｎ
ＤＮＡ 位点发生了突变ꎬ其余均为野生型ꎮ 我们将这
３ 个突变株系分别命名为 Ｍｐｐｐ２ａ￣ａ￣１￣２￣１、Ｍｐｐｐ２ａ￣
胞芽杯和叶状体中均有表达ꎮ 其中ꎬ在顶端缺口
ａ￣１￣２￣３ 和 Ｍｐｐｐ２ａ￣ａ￣１￣２￣５ꎮ
处的表达量最高ꎬ其次为叶状体ꎬ而在胞芽杯中的
２.５ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 敲除突变体的表型分析
表达量最低ꎮ
胞芽是地钱的无性繁殖体ꎬ能够快速增加个
２.４ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因敲除突变体的构建 体数量ꎬ并且能够保持遗传稳定性ꎻ此外ꎬ胞芽有
２.４.１ ｓｇＲＮＡ 载 体 构 建 将 ２ 条 ｓｇＲＮＡ Ｏｌｉｇｏ 退 利于地钱更好地适应不同的环境条件ꎬ提高其对
火ꎬ形 成 双 链 后 连 接 到 ＰｓｔＩ 与 ＳａｃＩ 酶 切 后 的 严苛环境的适应能力ꎮ 因此ꎬ我们进一步以野生
ｐＭｐＧＥ￣Ｅｎ０１ 入门载体上ꎬ转化入大肠杆菌感受态 型 Ｔａｋ１ 为对照ꎬ分析了 Ｍｐｐｐ２ａ￣ａ 突变体植株的胞
细胞中ꎬ并挑取单克隆菌落测序ꎬ结果显示载体构 芽生长情况ꎮ 当地钱的胞芽杯充满胞芽时( 约 ２２
ＴＭ ＴＭ
建 正 确 ( 图 ９ )ꎮ 通 过 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ｄ)ꎬ我们分别在野生型 Ｔａｋ１ 和 ３ 种突变体的胞芽
Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘꎬ将 ｓｇＲＮＡ 从 ｐＭｐＧＥ￣Ｅｎ０１(入门载体) 杯中各取 ５０ 个胞芽进行统计ꎬ利用 Ｉｍａｇｅ Ｊ 测量
置换入 ｐＭｐＧＥ０１０ 质粒( 表达载体) 上ꎬ转入大肠 其面积ꎮ 统计结果 (图 １１:Ａ) 显示ꎬ 野生型 Ｔａｋ１
