Page 134 - 《广西植物》2025年第7期
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１ ３ ２ ６ 广 西 植 物 ４５ 卷
表 １ 本实验所用引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
引物名称 引物序列 (５′－３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)
ＭｐＰＰ２Ａ￣ＣＤＳ￣Ｆ ＧＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＣＧＡＧＣＣ
ＭｐＰＰ２Ａ￣ＣＤＳ￣Ｒ ＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＣＧＣＧＣＡＣＡＴＧＡＣＴＴＧＣＴＣＧ
ＭｐＰＰ２Ａ￣ｑＰＣＲ￣Ｆ ＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＡＡＧ
ＭｐＰＰ２Ａ￣ｑＰＣＲ￣Ｒ ＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＣ
ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣１￣Ｆ ＧＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＧＣＣＧＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡ
Ｍ１３Ｒ ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ
ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣１２￣ｊｃ￣Ｆ ＡＴＧＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＡＣＧＡＧＣＣ
ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣１２￣ｊｃ￣Ｒ ＣＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＡＴＧＡＡＣＣＡＧＴＣＧ
ＭｐＡＰＴ３￣ｑＰＣＲ￣Ｆ ＣＧＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＣＴＡＣＣ
ＭｐＡＰＴ３￣ｑＰＣＲ￣Ｒ ＧＴＡＣＣＣＣＣＧＧＴＴＧＣＡＡＴＡＡＧ
Ｃａｓ９￣Ｆ ＣＡＧＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＡＡＧＣＡＣＧＴＴＧ
Ｃａｓ９￣Ｒ ＡＧＣＧＡＡＡＴＣＣＣＴＴＣＣＣＴＴＡＴＣＣＣ
Ｏｌｉｇｏ１ ＧＣＡＣＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＧＧＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡ
Ｏｌｉｇｏ２ ＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣＣＣＧＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣ
(５′￣ ｔｔｃｔａｇｃｔｃｔａａａａｃＣＣＧＴＴＧＧＡＧ ＡＣＴＣＴＧＴＧＴＡＣｃｇ 伤口ꎬ在 ２２ ℃ 的全光照培养箱中预培养 ３ ｄꎻ同时
ａｇａｇｇｃｔｇｇｇｔｇｃ￣３′)ꎬ 其中小写部分为接头ꎬ大写部分 活化含有 ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 基因敲除载体的农杆菌ꎻ３ ｄ
为目的序列ꎮ ２ 条 ｓｇＲＮＡ 进行退火反应ꎬ反应体 后将农 杆 菌 与 预 培 养 的 Ｔａｋ１ 在 ２２ ℃ １５０ ｒ
￣１
￣１
系包 括 Ｏｌｉｇｏ１ ( １０ μｍｏｌ Ｌ ) １０ μＬ、 Ｏｌｉｇｏ２ ( １０ ｍｉｎ 、全光照条件下共培养 ３ ｄꎮ 随后用无菌水清
μｍｏｌＬ )１０ μＬ、ｄｄＨ Ｏ １０ μＬꎮ 将配制好的体系 洗与农杆菌共培养的地钱ꎬ将其铺入筛选培养基
￣１
２
混匀、瞬离ꎬ９６ ℃ 反应 ５ ｍｉｎꎬ自然冷却至室温ꎮ (含潮霉素、头孢)中培养 ３ 周左右ꎬ获得转化子ꎮ
将 ｐＭｐＧＥ￣Ｅｎ０１ 质 粒 ( 入 门 载 体) 用 ＰｓｔＩ 与 利用 ＣＴＡＢ 法提取转化子的 ＤＮＡꎬ利用 Ｃａｓ９￣
ＳａｃＩ 双酶切处理并回收ꎬ用南京诺唯赞生物有限 Ｆ / Ｃａｓ９￣Ｒ 引物通过 ＰＣＲ 鉴定载体是否插入地钱
公司 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ Ⅱ重组克隆试剂盒将引物退火产 基因组中ꎬ随后再利用检测引物 ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣ｊｃ￣
物与酶切后的质粒连接ꎬ并将连接产物转化入大 １２￣Ｆ / ＭｐＰＰ２Ａ￣ｃｒｉｓｐｒ￣ｊｃ￣１２￣Ｒ 扩增包含 ｇＲＮＡ 靶位
肠杆菌感受态细胞中ꎬ涂布于含卡那霉素的 ＬＢ 固 点所在的 ＤＮＡ 片段ꎬ将 ＰＣＲ 产物送福州尚亚生物
体平板上ꎬ３７ ℃ 过夜培养ꎬ挑取单克隆ꎬ通过菌落 技术有限公司测序ꎮ 测序结果运用 ＳｎａｐＧｅｎｅ 与野
ＰＣＲ 进行验证、摇菌ꎬ送福州尚亚生物技术有限公 生型 Ｔａｋ１ 序列比对ꎬ分析基因敲除情况ꎮ
ＴＭ ＴＭ
司测序ꎮ 利用 Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ｅｎｚｙｍｅ ｍｉｘꎬ
将测序正确的质粒(含有 ａｔｔＬ 位点的入门载体) 与 ２ 结果与分析
目的载体(含有 ａｔｔＲ 位点)进行体外重组ꎮ 重组产
物转化入大肠杆菌感受态细胞中ꎬ涂布于含壮观 ２.１ ＭｐＰＰ２Ａ￣Ａ 的编码区全长克隆
霉素的 ＬＢ 固体平板上ꎬ３７ ℃ 过夜培养ꎬ挑取单克 在拟南芥中ꎬ已明确编码 ＰＰ２Ａ￣Ａ 的基因有 ３
隆ꎬ通过菌落 ＰＣＲ 进行验证、摇菌ꎬ并送福州尚亚 个ꎬ 即 ＰＰ２Ａａ１ / ＲＣＮ１、 ＰＰ２Ａａ２ 及 ＰＰ２Ａａ３ꎬ Ｌｏｃｕｓ
生物技术有限公司测序ꎮ 测序成功后提取质粒转 分别是 Ａｔ１ｇ２５４９０、Ａｔ３ｇ２５８００ 及 Ａｔ１ｇ１３３２０ꎮ 为了
入农杆菌感受态细胞中ꎮ 寻 找 地 钱 中 的 同 源 基 因ꎬ 我 们 在 地 钱 网 站
１.３.５ 地钱转化、突变体鉴定及表型分析 取生长 (ｈｔｔｐｓ: / / ｍａｒｃｈａｎｔｉａ.ｉｎｆｏ / )进行了氨基酸序列比对
约 １４ ｄ 的野生型地钱 Ｔａｋ１ꎬ将其叶状体四周切出 分析ꎮ 结果显示ꎬ 地钱中仅有 １ 条相似度极高的
