Page 170 - 《广西植物》2025年第7期
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１ ３ ６ ２ 广 西 植 物 ４５ 卷
验证功能的其他物种 ＬＣＹＢ 和 ＬＣＹＥ 的氨基酸序 ２.２ 系统进化分析
列ꎬ利用 ＭＥＧＡ１１ 邻接法构建系统进化树ꎮ 使用 ＮＣＢＩ 的 ＢＬＡＳＴｐ 程 序 对 ＤｈＬＣＹＢ 和
１.５ ＤｈＬＣＹＢ 和 ＤｈＬＣＹＥ 的表达量分析 ＤｈＬＣＹＥ 的氨基酸序列进行同源性比对ꎬ再结合已
基于 ＤｈＬＣＹＢ 和 ＤｈＬＣＹＥ 的 ＯＲＦ 序 列ꎬ利 用 知的其他物种 ＬＣＹＢ 和 ＬＣＹＥ 氨基酸序列ꎬ 利用
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ６.０ 软件设计荧光定量引物ꎬ反应体 ＭＥＧＡ１１ 邻接法构建系统进化树分析其系统进化关
系及反应条件按照试剂(２×Ｑ３ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ 系ꎮ 秋石斛 ＤｈＬＣＹＢ 归为 ＬＣＹＢ 分簇ꎬＤｈＬＣＹＥ 则
ｍｉｘꎬＴＯＬＯＢＩＯ)说明书进行ꎮ 实验设置 ３ 个生物 归为 ＬＣＹＥ 分簇ꎮ 秋石斛 ＤｈＬＣＹＢ 蛋白与同为石斛
学重复ꎬ以 β￣ａｃｔｉｎ 和 ＴＵＡ 为内参基因( 侯天泽等ꎬ 属的铁皮石斛 ＤｃＬＣＹＢ、鼓槌石斛 ＤｃｈＬＣＹＢ 聚在一
２０２２)ꎬ分析 ＤｈＬＣＹＢ、ＤｈＬＣＹＥ 及 ＰＳＹ 在不同花色 类ꎬ与文心兰、深圳拟兰也有很高的相似性ꎬ而与烟
－△△Ｃｔ 计 草、番茄、圆叶牵牛的相似度较低ꎮ 对于 ＬＣＹＥꎬ秋
秋石斛花发育不同阶段的表达量ꎮ 采用 ２
算相对 表 达 量ꎬ以 及 使 用 ＴＢｔｏｏｌｓ￣Ⅱ 绘 制 表 达 量 石斛 ＤｈＬＣＹＥ 亦与同属的铁皮石斛 ＤｃＬＣＹＥ 和鼓槌
热图ꎮ 石斛 ＤｃｈＬＣＹＥ 的 同 源 性 最 高ꎬ 与 小 兰 屿 蝴 蝶 兰
１.６ 类胡萝卜素靶向代谢组学分析 (ＰｅＬＣＹＥ)也有很相近的同源性ꎬ而与桃、梅、欧洲
秋石斛初开期的花被片(包括花瓣、唇瓣和萼 油菜、拟南芥则最远(图 ４:Ａ)ꎮ
片)液氮冷冻送往武汉迈维代谢生物科技股份有 ２.３ ＤｈＬＣＹＢ 和 ＤｈＬＣＹＥ 的蛋白生物信息学分析
限公司进行类胡萝卜素靶向代谢组学分析ꎮ 分析 经 Ｅｘｐａｓｙ ＰｒｏＰａｒａｍ 分析ꎬ ＤｈＬＣＹＢ 分子 量 为
方法参考 Ｓｕ 等 (２０２３)ꎮ 依据 ＭＷＤＢ 数据库( 武 ５６ １０７.８５ Ｄａꎬ分子式为 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ等电点
２５２６ ３９６９ ６９５ ７０８ ２２
汉迈维代谢生物科技股份有限公司)ꎬ依据 ｓＭＲＭ 为 ８.０７ꎬ带 ５５ 个负电荷(Ａｓｐ ＋ Ｇｌｕ)和 ５７ 个正电荷
( ｓｃｈｅｄｕｌｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ)对类胡萝卜 (Ａｒｇ ＋ Ｌｙｓ)氨基酸残基ꎻ不稳定指数为４８.９９ꎬ属于
素代谢物进行定性和定量分析ꎮ 不稳定蛋白ꎮ 而 ＤｈＬＣＹＥ 分子量为５９ ３３０.７６ Ｄａꎬ分
子式为 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ等电点为 ７.９５ꎬ分别带
２６６８ ４１９８ ７１６ ７５６ ２９
２ 结果与分析 ５９ 个负电荷 ( Ａｓｐ ＋ Ｇｌｕ) 及 ６１ 个正电荷 ( Ａｒｇ ＋
Ｌｙｓ)氨基酸残基ꎻ不稳定指数为 ４５.８５ꎬ亦属于不稳
２.１ 基因克隆及序列分析 定 蛋 白ꎮ 使 用 在 线 工 具 Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ ( ｈｔｔｐ:/ /
以秋石斛品种‘金童’ｃＤＮＡ 为模板ꎬ经克隆、测 ｗｗｗ. ｃｓｂｉｏ. ｓｊｔｕ. ｅｄｕ. ｃｎ / ｂｉｏｉｎｆ/ ｐｌａｎｔ￣ｍｕｌｔｉ/ ＃) 分析亚
序得到 ＤｈＬＣＹＢ 和 ＤｈＬＣＹＥ 的全长序列(图 ２)ꎮ 其 细胞定位显示ꎬＤｈＬＣＹＢ 与 ＤｈＬＣＹＥ 均定位于叶绿
中ꎬＤｈＬＣＹＢ 全长为 １ ７１９ ｂｐꎬＯＲＦ 为 ９６ ~ １ ６１４ ｂｐꎬ 体ꎮ 利 用 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐ
编码 ５０２ 个氨基酸ꎻＤｈＬＣＹＥ 全长为 １ ７２２ ｂｐꎬＯＲＦ ａｓｙ. ｏｒｇ / ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ) 在 线 工 具 预 测 ＤｈＬＣＹＢ 和
为 １０４~１ ６８７ ｂｐꎬ编码 ５２８ 个氨基酸ꎮ 氨基酸序列 ＤｈＬＣＹＥ 的三维结构(图 ４:Ｂ、Ｃ)ꎮ 可见 ＤｈＬＣＹＢ 和
一致性比对结果显示ꎬＤｈＬＣＹＢ 与同属的铁皮石斛 ＤｈＬＣＹＥ 在外形上高度相似ꎬ各由一个主体加上一
ＤｃＬＣＹＢ 及鼓槌石斛 ＤｃｈＬＣＹＢ 相似性最高ꎬ分别为 条不规则延伸链组成ꎮ 在两者的主体中ꎬ包含了较
９６.９１％ 和 ９６. ０２％ꎬ 与 同 科 的 文 心 兰 相 似 性 为 多的 α￣螺旋、β￣折叠及无规则延伸ꎮ
７８.４８％ꎮ 而在其他园艺作物中ꎬ与黄水仙 ＮｐＬＣＹＢ ２.４ ＤｈＬＣＹＢ 和 ＤｈＬＣＹＥ 的表达特征
氨基酸相似性最高ꎬ为 ７１.０９％ꎮ ＤｈＬＣＹＥ 亦与同属 利用 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 分析了 ＤｈＬＣＹＢ 和 ＤｈＬＣＹＥ 在
的 ＤｃＬＣＹＥ 及 ＤｃｈＬＣＹＥ 氨基酸序列相似性最高ꎬ分 ５ 个不同花色品种的花发育的 ３ 个阶段( Ｓ１、Ｓ２ 和
别为 ９５. ２７％、 ９５. ４５％ꎬ 与 同 科 的 小 兰 屿 蝴 蝶 兰 Ｓ３)的相对表达量ꎮ ＤｈＬＣＹＢ 和 ＤｈＬＣＹＥ 在不同秋
ＰｅＬＣＹＥ 相似性为 ８９.５８％ꎮ 与兰科之外的园艺作 石斛开花不同阶段表达特征各异( 图 ５)ꎮ 对所有
物最相似的是水仙 ＮｔｃＬＣＹＥꎬ为 ７２.７１％ꎮ 除此以 被测样品ꎬＤｈＬＣＹＢ 在‘ 红霞’ Ｓ３ 阶段表达量最高ꎬ
外ꎬ这些同源物都包含了之前被证明是植物番茄红 在‘绿色之星’ Ｓ３ 阶段最低ꎮ 在‘ 金公主’ 和‘ 红
素环化酶特征的保守基序ꎬ如 １ 个二核苷酸结合结 霞’的 ３ 个花发育阶段中ꎬＤｈＬＣＹＢ 的表达量逐渐
构域(ｄｉ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ)、２ 个环化酶基序 上升ꎻ在‘三亚阳光’ 中则先下降后上升ꎻ在‘ 青苹
( ｃｙｃｌａｓｅ ｍｏｔｉｆ ) 和 ２ 个 跨 膜 螺 旋 ( ＴＭ ｈｅｌｉｘ ) 果’则一直下降ꎻ在‘绿色之星’中的表达量为先上
(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９６)(图 ３)ꎮ 升后下降ꎮ
