Page 169 - 《广西植物》2025年第7期

７ 期 陈曼曼等: 秋石斛 ＬＣＹＢ、ＬＣＹＥ 基因克隆和表达分析及其与花色的关系 １ ３ ６ １

昕等ꎬ２０２０ꎻ郑清冬等ꎬ２０２１)ꎮ 而在另一个分支 ｃｍ)、大花芽(长度 ２ ~ ３ ｃｍ)和初开( 萼片和花瓣
中ꎬＬＣＹＥ 及 ＬＣＹＢ 将全反式番茄红素的两端催化 刚张开)３ 个阶段ꎮ 采集各发育时期的花被片( 包
形成 ɛ 环和 β 环ꎬ生成 α￣胡萝卜素ꎬ进一步羟基化 括花瓣、萼片和唇瓣)ꎬ置于液氮中速冻ꎬ－８０ ℃ 保

后形成叶黄素(ｌｕｔｅｉｎ)ꎮ 存用于提取 ＲＮＡ 和类胡萝卜素代谢产物测定ꎮ
石斛兰为兰科石斛属植物ꎬ具有极高的观赏价 １.２ 花色测量
值ꎬ与卡特兰、蝴蝶兰、万代兰并列为观赏价值最高 根据殷涵泰等(２０２１) 的方法ꎬ利用分光色差
的“四大观赏洋兰”ꎮ 石斛兰作为切花和盆花产品 仪(ＮＦ５５５ 型ꎬ日本电色工业株式会社) 测定花瓣
已成为花卉产业中最重要的商品兰花之一ꎮ 在我 及萼片在 ＣＩＥＬａｂ 表色系统的明度 Ｌ 值和色相 ａ ∗
∗
∗
国园艺栽培中ꎬ 石 斛 兰 主 要 分 为 春 石 斛 ( Ｎｏｂｉｌｅ￣ 值、ｂ 值ꎬ并计算色相角 ｈꎬ测定孟赛尔颜色系统的
ｔｙｐｅ ) 和 秋 石 斛 ( Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ￣ｔｙｐｅ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ Ｈ(色调) 值、Ｖ( 明度) 值、Ｃ( 彩度) 值ꎮ 利用英国
ｈｙｂｒｉｄｓꎬＤｅｎ￣Ｐｈａｌｓ) 两大类ꎮ 春石斛主要作为盆栽 皇 家 园 艺 学 会 比 色 卡 ( ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ
花卉ꎬ较为耐寒ꎬ自然花期在 ３—５ 月ꎬ是重要的早春 Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｃｏｌｏｕｒ Ｃｈａｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ ＫｉｎｇｄｏｍꎬＲＨＳＣＣ)
盆花ꎻ秋石斛适宜高温多湿的环境ꎬ多数品种开花 描述初开期花瓣及萼片颜色( 表 １)ꎮ 每个品种选
高峰期在秋季ꎬ整个花序可开放长达数月ꎮ 目前ꎬ 取来自不同植株具典型花色特征的花朵 ３ ~ ４ 个ꎬ
秋石 斛 品 种 花 色 以 紫 红 色 调 为 主 ( 殷 涵 泰 等ꎬ 每朵花测定 ３ 次ꎮ
２０２１)ꎬ其花色素主要由花青素苷组成(李崇晖等ꎬ １.３ 总 ＲＮＡ 提取与 ｃＤＮＡ 第一条链合成
２０１３)ꎮ 黄色和绿色的花色则由类胡萝卜素和叶绿 使用多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒[ 天根
素组成ꎬ叶黄素、玉米黄质、紫黄质及新黄质则被认 生化科技( 北京) 有限公司] 提取样品总 ＲＮＡꎬ用
为是黄花秋石斛中的主要色素(Ｔｈａｍｍａｓｉｒｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬＲＮＡ 样品质量符合标准
１９８６)ꎮ 与花青素苷相关研究相比ꎬ关于秋石斛花 后ꎬ使用反转录试剂( ＴＯＬＯＢＩＯ) 合成 ｃＤＮＡꎬ置于
中类胡萝卜素相关研究则少见报道且其类胡萝卜 －２０ ℃ 冰箱备用ꎮ
素生物合成和调控过程尚未被阐明ꎮ 因此ꎬ深入挖 １.４ ＬＣＹＢ、ＬＣＹＥ 克隆及生物信息学分析
掘秋石斛类胡萝卜素色素组成及解析黄色秋石斛 基于本研究团队秋石斛品种‘ 金童’ 转录组数
花朵中呈色的机制十分必要ꎮ 据( Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２５ ) 筛 选 得 到 基 因 ＬＣＹＢ 和
本研 究 以 秋 石 斛 品 种 ‘ 金 童’ ( Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ＬＣＹＥꎬ使用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ６.０ 软件基于 ＣＤＳ 序列
‘Ｔｈｏｎｇｃｈａｉ Ｇｏｌｄ’)为材料ꎬ克隆得到基因 ＤｈＬＣＹＢ 设 计 特 异 性 引 物 ＬＣＹＢ￣Ｆ、 ＬＣＹＢ￣Ｒ 及 ＬＣＹＥ￣Ｆ、
和 ＤｈＬＣＹＥꎬ对其进行生物信息学分析ꎬ并研究了 ＬＣＹＥ￣Ｒ( 表 ２)ꎮ 以 １.３ 中所获得的‘ 金童’ 花芽
不同颜色秋石斛品种不同发育阶段的基因表达特 ｃＤＮＡ 第一链为模板ꎬ用 ＤＮＡ 高保真酶( Ｖａｚｙｍｅ)
征ꎬ以期为秋石斛类胡萝卜素花色相关基因挖掘 试剂说明书进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ＰＣＲ 产物经琼脂糖
和花色改良奠定基础ꎮ 凝胶电泳后回收电泳产物ꎬ并连接到 Ｔ 载上ꎮ 连
接产物转化到大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态ꎬ阳性菌落
１ 材料与方法 经 ＰＣＲ 检测后测序ꎮ 序列信息已提交中国国家生
物信 息 中 心 ＧｅｎＢａｓｅ 数 据 库ꎬ 序 列 号 分 别 为
１.１ 实验材料 ＤｈＬＣＹＢ ( Ｃ ＿ ＡＡ０９９４８５. １ )、 ＤｈＬＣＹＥ ( Ｃ ＿
本试验的植物材料均来自中国热带农业科学 ＡＡ０９９４８６.１)ꎮ
院热带作物品种资源研究所热带花卉研究中心的 利用 ＮＣＢＩ 在线工具查找开放阅读框ꎬ以及在
热带兰种质资源圃所收集和保存的资源ꎮ 用于克 线网站 Ｅｘｐａｓｙ ＰｒｏＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ /
隆基因 的 品 种 ‘ 金 童’ 大 花 芽 ( 长 度 约 ２ ｃｍ) 的 ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )预测基因编码区长度、蛋白的氨基酸

ｃＤＮＡ 来源于转录组测序样品( Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２５)ꎮ 序列长度、分子量、分子式、等电点等ꎻ利用 ＳＷＩＳＳ￣
用于研究基因表达量和类胡萝卜素成分分析的植 ＭＯＤＥＬ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐ ａｓｙ. ｏｒｇ /
物材料为不同花色品种的‘ 金公主’ ‘ 青苹果’ ‘ 绿 ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ) 在 线 工 具 预 测 其 三 维 结 构ꎮ 并 通 过
色之星’‘三亚阳光’ ‘ 红霞’ 的花器官为材料( 图 ＮＣＢＩ 的 ＢＬＡＳＴｐ 程序对 ＬＣＹＢ 和 ＬＣＹＥ 进行同源
１)ꎮ 将花发育过程分为中花芽( 长度 １.５ ~ ２.２ 性比对ꎬ再结合 ＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ 数据库中部分已报道