Page 193 - 《广西植物》2026年第1期

１ 期 代英超等: 不同生长年限短萼黄连根内及根际微生物群落多样性研究 １ ８ ９

１.３ 文库构建与测序 细菌还是真菌群落ꎬ根组织样本的有效序列均高
® Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ￣Ｓｅｑ Ｋｉｔ 构 建 于根际土壤样本ꎬ但 ＯＴＵｓ 数目则显著低于根际土
使 用 ＮＥＸＴＦＬＥＸ
ＰＣＲ 产物的文库ꎮ 过程包括:(１) 接头连接ꎻ(２) 壤样本ꎮ
通过磁珠筛选去除接头自连的片段ꎻ(３) 利用 ＰＣＲ 通过构建稀释曲线发现ꎬ随着抽取序列数的
扩增富集文库模板ꎻ(４) 使用磁珠回收 ＰＣＲ 产物ꎬ 增加ꎬ曲线在达到一定高度后趋于平稳( 图 １)ꎬ表
获得最终文库ꎮ 利用上海美吉生物医药科技有限 明测序的深度足以覆盖样品中的大多数细菌和真

公司 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＰＥ３００ / ＰＥ２５０ 平台进行测序ꎮ 菌种类ꎬ并且样本数量可满足后续生物信息学分
１.４ 高通量测序数据质控与统计分析 析的需求ꎮ

先 使 用 Ｆａｓｔｐ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｇｉｔｈｕｂ. ｃｏｍ / ＯｐｅｎＧｅｎｅ / ２.２ 不同年限短萼黄连根内及根际微生物群落多
ｆａｓｔｐꎬｖｅｒｓｉｏｎ ０.１９.６) 对双端原始测序数据进行质 样性分析

量 筛 查ꎬ 再 使 用 ＦＬＡＳＨ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｃｂ. ｕｍｄ. 供试 样 本 的 微 生 物 群 落 的 丰 度 指 数 ( Ａｃｅ、
ｅｄｕ / ｓｏｆｔｗａｒｅ / ｆｌａｓｈꎬｖｅｒｓｉｏｎ １.２.１１) 进行拼接ꎮ 拼接 Ｃｈａｏ １)和多样性指数( Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｓｉｍｐｓｏｎ) 见表 １ꎮ

后ꎬ应用 ＵＰＡＲＳＥ １１( ｈｔｔｐ: / / ｄｒｉｖｅ５. ｃｏｍ / ｕｐａｒｓｅ / ) 无论在根组织样本还是根际土壤样本中ꎬ随着生
对数据进行可操作分类单位( ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ 长年限的增加ꎬ细菌的 Ａｃｅ 指数和 Ｃｈａｏ １ 指数无
ｕｎｉｔｓꎬＯＴＵｓ)聚类ꎬ聚类阈值设定为 ９７％相似度ꎬ并 显著 变 化ꎬ 而 细 菌 Ｓｈａｎｎｏｎ 指 数 呈 下 降 趋 势ꎬ
去除嵌合体序列ꎮ 剔除叶绿体和线粒体序列后ꎬ Ｓｉｍｐｓｏｎ 指数呈上升趋势ꎬ说明生长年限对细菌群
抽平 各 样 本ꎬ 确 保 ９９. ０９％ 以 上 的 序 列 覆 盖 度 落丰度影响不大ꎬ但对细菌多样性影响显著ꎮ
(Ｇｏｏｄ’ ｓ ｃｏｖｅｒａｇｅ)ꎮ 使 用 ＲＤＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ ( ｈｔｔｐ: / / 在真菌方面ꎬ随着生长年限的增加ꎬ根内真菌
ｒｄｐ. ｃｍｅ. ｍｓｕ. ｅｄｕ / ꎬ ｖｅｒｓｉｏｎ ２. １１ ) 结 合 Ｓｉｌｖａ １６Ｓ 的 Ａｃｅ 指 数 和 Ｃｈａｏ １ 指 数 无 显 著 性 差 异ꎬ 而
ｒＲＮＡ 数 据 库 ( ｖ１３８) 和 ＵＮＩＴＥ 真 菌 ＩＴＳ 数 据 库 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数和 Ｓｉｍｐｓｏｎ 指数呈先降后升趋势ꎮ 根
(ｖ８.０)进行物种注释ꎬ置信度为 ７０％ꎬ并统计群落 际土壤中真菌 Ａｃｅ 和 Ｃｈａｏ １ 指数逐年升高ꎬ但在
结构ꎮ 两年生和多年生间无显著性差异ꎻＳｈａｎｎｏｎ 指数和
所有数 据 分 析 在 美 吉 生 物 云 平 台 ( ｈｔｔｐｓ: / / Ｓｉｍｐｓｏｎ 指数变化不显著ꎬ说明所选生长年限的短
ｃｌｏｕｄ.ｍａｊｏｒｂｉｏ. ｃｏｍ) 上进行ꎬ具体流程如下:使用 萼黄连对根际土壤中真菌的多样性作用较小ꎮ 进
ｍｏｔｈｕｒ 软件计算 α 多样 性 指 数ꎬ并 结 合 Ｋｒｕｓｋａｌ￣ 一步比较同一年限短萼黄连根内和根际微生物多
Ｗａｌｌｉｓ 秩和检验分析组间差异ꎻ基于 Ｂｒａｙ￣Ｃｕｒｔｉｓ 距 样性指数ꎬ结果显示ꎬ无论是细菌还是真菌ꎬ根际
离进行 ＰＣｏＡ 分析ꎬ结合 ＡＮＯＳＩＭ 检验评估微生物 土壤中的 Ａｃｅ 指数、Ｃｈａｏ １ 指数和 Ｓｈａｎｎｏｎ 指数均
群落结构相似性及组间差异显著性ꎻ采用 ＬＥｆＳｅ 分 显著高于根组织样本ꎬ说明其微生物物种丰富度
析(ＬＤＡ 阈值>３.５ꎬＰ<０.０５) 识别各组从门到属层 和多样性高于根内生菌ꎮ
级上的显著丰度差异的微生物类群ꎮ ２.３ 不同年限短萼黄连根内和根际土壤样品比较
分析
２ 结果与分析 基于 Ｂｒａｙ￣Ｃｕｒｔｉｓ 算法ꎬ 利 用 主 坐 标 ( ｐｒｉｎｃｉｐａｌ
ｃｏ￣ｏｒｄｉｎａｔｅｓ ａｎａｌｙｓｉｓꎬＰＣｏＡ) 进行基于 ＯＴＵｓ 水平的
２.１ 不同年限短萼黄连根内及根际微生物测序数 微生物群落组成相似度分析ꎮ 经 ＡＮＯＳＩＭ 检验表
据统计 明ꎬ在细菌水平上ꎬ同一生长年限短萼黄连根和根
从 ３０ 个 根 组 织 和 土 壤 样 本 中 分 别 获 得 际土样本中细菌聚集在一起ꎬ不同生长年限的样本
１ ３３５ ６３０条和 １ １４９ ７８６ 条细菌优化序列ꎬ平均长 分离(根:Ｒ ＝ ０.６９５ꎬＰ ＝ ０.００１ꎻ根际土:Ｒ ＝ ０.７００ꎬ
２
２
度分别为 ３７７ ｂｐ 和 ２５６ ｂｐꎮ 通过 ９７％ 相似度聚 Ｐ ＝ ０.００１)ꎬ解释率分别为 ４９.３６％和 ４３.１６％(图 ２:
类ꎬ高质量序列共分别聚类成 ６ １０２ 个和 １３ ３０４ Ａ、Ｂ)ꎮ 在真菌水平上ꎬ同一生长年限根内真菌没有
个细菌 ＯＴＵｓꎮ 真菌 ＩＴＳ 测序结果显示ꎬ根组织和 聚在一起ꎬ组间不能很好分离(图 ２:Ｃ)ꎮ 然而ꎬ同
土壤样本分别获得 １ ５２６ ９７３ 条和 ７６２ １３６ 条真菌 年根际土 ＲＳ１、ＲＳ２、ＲＳ３ 样本聚集在一起ꎬ不同年限
优化序列ꎬ平均长度分别约为 ２５７ ｂｐ 和 ２３８ ｂｐꎬ最 之间样本可分离(Ｒ ＝ ０.８２８ꎬ Ｐ ＝ ０.００１)ꎬ组间差异
２
终分别聚类为 １ ６７５ 个和 ４ ２１４ 个 ＯＴＵｓꎮ 无论是 显著可见ꎬ解释率为 ４３.４６％(图 ２:Ｄ)ꎮ