Page 21 - 《广西植物》2020年第1期

１ 期 王发明等: 探讨植物单染色体测序中的假阳性问题 １ ７

ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ｗｉｌｌ ｂｅ ｒｅｍｏｖｅｄ ａｎｄ ｂｅ ｏｆ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｔｏ ｄａｔｅ ｎｏ ｃｌａｉｍｓ ｏｎ ｔｈｅ ｓｕｃ￣
ｃｅｓｓｆｕｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｉｌｕｒｅ ａｒｅ ｐｏｏｒｌｙ ｕｎｄｅｒｓｔｏｏｄ. Ｔｈｅ ｉｓｓｕｅ ｏｆ
ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ
ｓｉｎｇｌｅ￣ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ. Ｂｅｓｉｄｅｓꎬ ｔｈｅ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｂｏｄｙ ｗａｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｏ ｂｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｓｏｕｒｃｅｓ
ｏｆ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａｌｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｔｏｏｌｓꎬ ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｐａｃｅｓ ｂｅｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｓｔｅｒｉｌｉｚｅｄ ｔｒｅａｔ￣
ｍｅｎｔｓ. Ｔｈｅ ｓｕｐｅｒ ｈｅｌｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｔｈｅｍｓｅｌｖｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｆａｉｌｕｒｅ ｉｎ ａｍｐｌｉｆｉ￣
ｃａｔｉｏｎꎬ ａｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｈａｒｄ ｔｏ ｂｉｎｄ ｔｏ ｓｔｒａｎｄｓ ｏｆ ＤＮＡ ｔｏ ｓｔａｒｔ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ. Ｆｉｎａｌｌｙꎬ ｓｏｍｅ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｐｕｔ
ｆｏｒｗａｒｄ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｌｅｓｓｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｓｉｎｇｌｅ￣ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｓｉｎｇｌｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅꎬ ｓｉｎｇｌｅ￣ｃｅｌｌ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎꎬ ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｓꎬ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ
ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ (ＭＤＡ)ꎬ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｎｄ ｌｏｏｐｉｎｇ￣ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅｓ (ＭＡＬＢＡＣ)

单细胞测序技术ꎬ是目前生命科学研究的热 离染色体进行体外扩增ꎬ可以避免细胞壁的干扰ꎬ
点技术之一ꎮ 单细胞测序技术可以在单个细胞水 目前虽然已有较多分离单条染色体并进行体外扩
平上ꎬ使用极微量模板对基因组、转录组和表观组 增的成功案例ꎬ但使用的主要是基于 ＰＣＲ 的全基
等进行高通量测序分析ꎬ可以获得用常规组织样 因组扩 增 技 术ꎬ 如 简 并 寡 核 苷 酸 引 物 扩 增 技 术
本无法获得的单个细胞的异质性信息ꎬ从而被广 (ＤＯＰ￣ＰＣＲ)(Ｔｅｌｅｎｉｕｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９２) 和接头介导的
泛应用于人类的疾病诊断、癌症的早期检测以及 ＰＣＲ 扩 增 技 术 ( ＬＡ￣ＰＣＲ ) ( Ｃｈｅｎ ＆ Ａｒｍｓｔｒｏｎｇꎬ
发育 生 物 学、 微 生 物 学 和 神 经 生 物 学 等 方 面 １９９５)ꎮ 这些技术存在非特异性扩增、扩增偏倚和
(Ｌａｓｋｅｎꎬ ２００７ꎻ Ｎａｖｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ꎻ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ 扩增结果基因组覆盖度低等问题ꎮ 如果能使用单
２０１５)ꎮ 目前ꎬ单细胞全基因组测序普遍使用的技 细胞测序技术进行植物单条染色体的扩增ꎬ则可
术ꎬ包括 多 重 置 换 扩 增 技 术 (ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ 以从根本上解决这些问题ꎬ具有可预期的广阔应
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＭＤＡ) (Ｈｏｓｏｎｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３) 和基于多 用前景ꎮ 但是ꎬ目前关于这方面研究的报道较少ꎮ
次退 火 环 状 循 环 的 扩 增 技 术 ( ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ 殷卉等(２０１５)在巴西橡胶树上尝试应用单细胞测
ａｎｄ ｌｏｏｐｉｎｇ￣ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｙｃｌｅｓꎬ ＭＡＬＢＡＣ ) 序技术对橡胶树单条染色体进行体外扩增ꎬ但一
(Ｚｏｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎮ 单细胞测序技术目前已广泛 直未见后续的研究报道ꎮ
应用于人类、动物和微生物等方面的研究ꎬ但在植 植物单条染色体的体外扩增除了对极微量模
物上的研究应用较少ꎬ主要原因是植物存在细胞 板的考验以外ꎬ外源污染的防控还是该技术应用
壁ꎬ使用普通方法难以进行分离和裂解ꎮ 严建兵 的重要环节ꎬ如何有效防控外源污染是微量模板
团队曾发现了一种简单可行的方法ꎬ成功分离出 能否正确扩增和保证后续测序质量的关键因素ꎮ
玉米小孢子四分体ꎬ并使用单细胞测序技术成功 但是ꎬ基于 ＭＤＡ、ＭＡＬＢＡＣ 技术的扩增敏感性ꎬ即
进行了全基因组测序ꎬ获得了多个创新性的科学 使有极微量外源核苷酸模板的存在也可能造成污
发现(Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 这是单细胞测序技术在植 染的扩增和放大ꎬ从而造成假阳性现象并导致扩
物上的首次成功应用ꎮ 然而ꎬ单细胞测序技术在 增失败ꎮ 扩增过程中外源污染可能来源于实验环

染色体水平上的应用却尚未见有成功的报道ꎮ 境ꎬ也可能来自实验试剂、水、各种缓冲液ꎬ扩增使
植物染色体是植物细胞在有丝分裂或减数分 用的枪头、离心管等耗材器具以及染色体制备和
裂时的超螺旋存在形式ꎬ是染色质的高级结构ꎬ容 分离过程 中 使 用 的 玻 片、 玻 璃 针 等 ( 王 发 明 等ꎬ
易分辨和分离ꎮ 那么ꎬ能否利用单细胞测序技术 ２０１０)ꎮ 此外ꎬ实验室环境下的气溶胶污染也不容
来进行单条植物染色体的体外扩增和测序呢ꎮ 单 忽视(杜茜等ꎬ２０１５)ꎮ 因此ꎬ只有在植物单染色体

细胞测序技术可以对单个微生物细胞进行测序ꎬ 体外扩增的各个环节都应该对外源污染进行严格
多数细菌基因组大小不足十兆ꎬ远低于很多植物 防控ꎬ才能保证扩增的高质量ꎮ
单条染色体的大小ꎬ因此利用单细胞测序技术进 目前ꎬ单染色体测序还未见有成功的报道ꎬ笔
行植物单染色体测序从理论上是可行的ꎮ 通过分 者在同测序公司和其他单位相关领域人员交流