Page 23 - 《广西植物》2020年第1期

１ 期 王发明等: 探讨植物单染色体测序中的假阳性问题 １ ９

表 １ 污染源排除实验设计
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅ

实验 样本 耗材 试剂
Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｋｉｔ
实验 １ 送检的 ＰＢＳ 和水以及空白各重复 ２ 次 ０.２ ｍＬ ＰＣＲ 管 合格试剂(１８０６Ｂ)
Ｔｅｓｔ １ Ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＰＢＳꎬ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ｅａｃｈ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｔｗｉｃｅ ０.２ ｍＬ ＰＣＲ ｔｕｂｅ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｋｉｔ (１８０６Ｂ)
实验 ２ 送检的 ＰＢＳ 和水以及空白各重复 ２ 次 质量部 ０.２ ｍＬ ＰＣＲ 管 合格试剂(１８０６Ｂ)
Ｔｅｓｔ ２ Ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ＰＢＳꎬ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ｅａｃｈ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｔｗｉｃｅ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ０.２ ｍＬ ＰＣＲ ｔｕｂｅ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｋｉｔ (１８０６Ｂ)
实验 ３ 质量部的无核酸酶水和空白各重复 ２ 次 ０.２ ｍＬ ＰＣＲ 管 合格试剂(１８０６Ｂ)
Ｔｅｓｔ ３ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ￣ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ｅａｃｈ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｔｗｉｃｅ Ｔｅｓｔ ｓａｍｐｌｅ ｏｆ ０.２ ｍＬ ＰＣＲ ｔｕｂｅ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｋｉｔ (１８０６Ｂ)
实验 ４ 质量部的无核酸酶水和空白各重复 ２ 次 质量部 ０.２ ｍＬ ＰＣＲ 管 送检的 １７０２Ａ 试剂
Ｔｅｓｔ ４ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ￣ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌꎬ ｅａｃｈ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｔｗｉｃｅ Ｑｕａｌｉｆｉｅｄ ０.２ ｍＬ ＰＣＲ ｔｕｂｅ Ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｋｉｔ (１７０２Ａ)

注: 由实验 １ 和实验 ２ 比对可得出是否是 ０.２ ｍＬ ＰＣＲ 管原因导致污染ꎻ由实验 １ 和实验 ３ 比对可得出是否是送检样本(水和 ＰＢＳ)
原因导致污染ꎻ由实验 ２ 中的空白对照和实验 ４ 中的空白对照得出是否是试剂原因导致污染ꎮ
Ｎｏｔｅ: Ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ０.２ ｍＬ ＰＣＲ ｔｕｂｅ ｗａｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｏｒ ｎｏｔ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｔｅｓｔ １ ａｎｄ Ｔｅｓｔ ２ꎻ Ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ
ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ (ｗａｔｅｒ ａｎｄ ＰＢＳ) ｂｙ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ Ｔｅｓｔ １ ａｎｄ Ｔｅｓｔ ３ꎻ Ｔｈｅ ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ｔｅｓｔ ２ ａｎｄ Ｔｅｓｔ ４ ｗｅｒｅ
ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｓ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｒｅａｇｅｎｔｓ.

表 ２ 用于检测单染色体扩增产物的 ＳＣｏＴ 引物 ＭＤＡ 技术的 ＲＥＰＬＩ￣ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ( Ｃａｔ Ｎｏ. / ＩＤ:

Ｔａｂｌｅ ２ ＳＣｏＴ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｈｅｃｋｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ￣ １５０３４３)进行扩增的结果显示( 图 ２)ꎬ包含全部染
ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
色体的完整细胞的扩增条带(１ 号泳道) 跟单个染
ＳＣｏＴ 引物 序列 (５′－３′) 色体的扩增条带( ２ 号泳 道) 带 型 基 本 一 致ꎮ 但
ＳＣｏＴ ｐｒｉｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)
是ꎬ两种方法中无菌水阴性对照(３ 号泳道)和 ＰＢＳ
Ｐ１７ ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＡＧ
阴性对照(４ 号泳道) 也分别扩增出了与目标样品
Ｐ２０ ＡＣＣＡＴＧＧＣＴＡＣＣＡＣＣＧＣＧ
明显类似的条带ꎮ 两种使用单细胞测序试剂盒进
行扩增的方法均出现假阳性现象ꎬ说明扩增过程
Ｐ２１ ＡＣＧＡＣＡＴＧＧＣＧＡＣＣＣＡＣＡ
中可能存在外源 ＤＮＡ 污染ꎮ
检合格后ꎬ使用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序平台进行高通量测 ２.３ 可能污染源的排除
序ꎬ 测序读长 ＰＥ１５０ꎮ 对过滤后的高质量数据随 为了排除假阳性现象出现的可能原因ꎬ我们
机抽取１０ ０００条 Ｒｅａｄｓ 数据ꎬ通过 Ｂｌａｓｔ 软件比对 委托亿康基因公司使用 ＭＡＬＢＡＣ 单细胞扩增试剂
盒ꎬ针对扩增过程中使用的无菌水、ＰＢＳ 溶液、离
ＮＴ 库ꎬ分析可能的污染源ꎮ
心管以及试剂盒本身分别进行了排除ꎮ 研究结果
２ 结果与分析 表明ꎬ体外扩增使用的水及各种试剂、耗材均未检
测到明显扩增ꎬ没有扩增条带出现( 图 ３:Ａ)ꎬ而阳

２.１ 小麦中期染色体制备和显微分离 性对照却扩增出了明显条带( 图 ３:Ｂ)ꎬ说明污染
在 ４０ 倍镜下ꎬ寻找到分散良好、视野清晰的 在可控范围之内ꎮ 经咨询公司得知ꎬ其检测时在
小麦中期染色体分裂相ꎬ制备微细玻璃针ꎬ使用显 第二轮扩增使用的是 １７ 个循环ꎬ不是本实验进行
微操作仪准确挑出单条小麦染色体( 图 １)ꎮ 染色 单染色体扩增使用的 ２１ 个循环ꎮ 当我们改为 １７
体通过静电作用吸附在针尖上ꎬ迅速转移至放有 个循环进行扩增时ꎬ染色体及阴性对照均没有扩
裂解液的 ２００ μＬ 离心管中ꎬ８ ０００ ｒｍｉｎ 简短离 增出条带ꎮ 这说明在较高的循环数下ꎬＢＡＬＢＡＣ
￣１
心 ２０ ｓꎬ进行后续扩增实验ꎮ 单细胞技术容易产生非特异性假阳性扩增ꎮ
２.２ ＭＡＬＢＡＣ 和 ＭＤＡ 方法对小麦染色体进行扩 ２.４ 使用 ＳＣｏＴ 分子标记对扩增结果进行初步验证
增出现假阳性现象 既然试剂耗材没有产生明显的外源污染ꎬ那
分别使用基于 ＭＡＬＢＡＣ 技术的 ＭＡＬＢＡＣ 微 么为什么使用 ＭＡＬＢＡＣ 技术扩增时增加循环数
量基因组快速扩增试剂盒( ＫＴ１１０７００３２４) 和基于 或者使用ＭＤＡ技术扩增时却均出现了较明显的假