Page 22 - 《广西植物》2020年第1期
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１ ８ 广 西 植 物 ４０ 卷
时ꎬ发现普遍存在假阳性现象严重而目标染色体 ２０１７ / １１２４ / ＫＴ１１０７００３ ＿ ＭＡＬＢＡＣｗｅｉｌｉａｎｇｊｉｙｉｎｚｕｋｕ￣
却没有得到有效扩增的问题ꎮ 针对这种问题ꎬ尚 ａｉｓｕｋｕｏｚｅｎｇｓｈｉｊｉｈｅｃｈａｎｐｉｎｓｈｕｏｍｉｎｇｓｈｕ ＿ ｚｈｏｎｇｗｅｎＰＭ￣
未见有人进行过系统研究和提出可行性建议ꎬ特 ４０ｃ９ｅ.ｐｄｆ)ꎮ 根据说明书分别将扩增循环数设置
别是对假阳性现象形成的原因和污染的主要来源 为适合单条染色体扩增的 ２１ 个循环和常规的 １７ 个
还认识不足ꎬ这样不利于有针对性地提出外源污 循环ꎮ 扩增完成后使用 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ
染防控策略和改进实验方案ꎮ １.２.３ 染色体 ＭＤＡ 扩增 分离后的包含全部染色
本研究尝试使用单细胞测序的方式对小麦单 体的 单 个 完 整 细 胞 和 单 条 小 麦 染 色 体 是 使 用
条染色体分离后进行体外扩增和测序ꎬ在严格防 Ｑｉａｇｅｎ 公司的 ＲＥＰＬＩ￣ｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｋｉｔ(Ｃａｔ Ｎｏ. / ＩＤ:
控外源污染的前提下ꎬ针对实验过程中普遍遇到 １５０３４３)来进行扩增ꎬ操作过程详情见使用说明书
的假阳性问题进行研究ꎬ旨在探讨其可能来源和 (ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｑｉａｇｅｎ. ｃｏｍ/ ｃｎ/ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ/ ｒｅｓｏｕｒｃｅｄｅｔａｉｌ?
形成原因ꎬ并针对单染色体测序存在的主要问题 ｉｄ＝ ３８ｆａｃａ１ｃ￣６４ｂ０￣４２８１￣ａａｂ３￣ａａ８３２４ｂｂｄ１８１＆ｌａｎｇ ＝ ｅｎ)ꎮ
提出可行性建议ꎬ以期为植物单染色体测序的开 扩增完成后ꎬ使用 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ 在使
展提供经验和参考ꎮ 用试剂盒自行体外扩增的同时ꎬ使用安诺优达基
因科技有限公司提供的解离液在分离部分单条染
１ 材料与方法 色体后委托其进行体外扩增ꎮ
１.２.４ 污染源排除实验 为了研究染色体扩增过
１.１ 植物材料 程中的假阳性现象以及对外源污染的可能来源进
六倍体中国春小麦(２ｎ ＝ ６ × ＝ ４２) 种子ꎬ由中 行排除ꎬ我们委托亿康基因公司使用 ＭＡＬＢＡＣ 技
国科学院遗传与发育生物学研究所王道文课题组 术对实验使用的无菌水、ＰＢＳ 溶液、离心管和试剂
提供ꎮ 盒本身进行了检测ꎮ 实验设计如表 １ 所示ꎮ
１.２ 方法 １.２.５ ＳＣｏＴ 分子标记检测 由于 ＳＣｏＴ 分子标记是
１.２.１ 小麦中期染色体制备和单条染色体分离 将 一种目标起始密码子多态性标记ꎬ因此可以用来
六倍体中国春小麦种子用冷水于 ４ ℃ 冰箱浸泡１ ｄ 检测外源污染物是来自其他外源物种基因还是因
后ꎬ置于 ２５ ℃ 下避光培养ꎬ当其根尖长至 １.５ ~ ２.０ 引物多聚体形成的ꎮ ＳＣｏＴ 引物是根据 Ｃｏｌｌａｒｄ ＆
ｃｍ 时ꎬ用锋利的刀片将其切下ꎬ用 ０.１％秋水仙素 Ｍａｃｋｉｌｌ (２００９) 和 Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ.(２０１１) 公布的引物序
预处理 ３ ｈꎬ 无 菌 水 洗 净 后 用 卡 诺 固 定 液 ( 冰 醋 列来合成ꎮ 本研究用于单染色体扩增产物的 ＰＣＲ
酸 ∶ 纯 酒 精 ＝ １ ∶ ３) 于 低 温 下 固 定 ５ ｍｉｎꎬ 转 入 检测的 ＳＣｏＴ 引物如表 ２ 所示ꎮ
７０％酒精中ꎬ４ ℃ 冰箱保存ꎮ 使用时用镊子取出所 使用 ２０ μＬ 反应体系:２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍｉｘ １０ μＬ、
需数量的根尖ꎬ用无菌水冲洗 ３ 遍ꎬ控干水分ꎮ 分 扩增产物(稀释 １ ０００ 倍ꎬ约 ３０ ｎｇμＬ ) １.０ μＬ、
￣１
￣１
别加入体积比 ４％和 ３％的纤维素和果胶酶 ２０ μＬꎬ １０ μｍｏｌＬ 引物 ０.８ μＬ、超纯水 ８.２ μＬꎮ 反应程
３７ ℃ 酶 解 ４５ ｍｉｎꎬ 酶 解 完 成 后ꎬ 用 无 菌 水 冲 洗 序:９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４ ℃ 变性 ４５ ｓꎬ５０ ℃ 退火 １
３ 遍ꎬ控干水分ꎬ滴加 １０ μＬ 卡宝品红染液ꎬ用枪头 ｍｉｎꎬ７２ ℃ 延 伸 ２ ｍｉｎꎬ循 环 ３５ 次ꎻ７２ ℃ 延 伸 １０
将根尖捣碎ꎬ略放置后进行压片ꎮ 先将压片完成 ｍｉｎꎮ 取 ８ μＬ 扩 增 产 物ꎬ使 用 ２％ 的 琼 脂 糖 电 泳
后的玻片置于－７０ ℃ 超低温冰箱中放置 ３０ ｍｉｎꎬ再 检测ꎮ
迅速揭掉盖玻片ꎬ置于倒置显微镜下观察和使用微 １.２.６ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交鉴定 将小麦全基因组 ＤＮＡ
细玻璃针法进行显微分离(Ｎｉｋｏｎ Ｔｉ￣Ｓ 研究级倒置 酶切产物与染色体扩增产物及阴性对照一起进行
显微操作系统)ꎮ 在分离单条染色体的同时ꎬ也分 电泳ꎬ并通过印记杂交的方式转移至带正电荷的
离包含全部中期染色体的单个完整细胞作为对照ꎮ Ｈｙｂｏｎｄ 尼龙膜上ꎬ小麦全基因组 ＤＮＡ 经酶切、标
１.２.２ 染色体 ＭＡＬＢＡＣ 扩增 分离后的包含全部 记后作为探针进行杂交ꎮ 具体操作步骤参照罗氏
染色体的单个完整细胞和单条小麦染色体是使用 公司生产的“ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅ￣
亿康公司的 ＭＡＬＢＡＣ 微量基因组快速扩增试剂盒 ｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｔａｒｔｅｒ￣ＫｉｔⅠ(Ｒｏｃｈｅ)”试剂盒说明书进行ꎮ
(ＫＴ１１０７００３２４)来进行扩增ꎮ 操作过程详情见使用 １.２.７ 高通量测序 选择小麦染色体假阳性扩增
说 明 书 ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｙｉｋｏｎｇｅｎｏｍｉｃｓ. ｃｏｍ/ ｕｐｌｏａｄ / 产物ꎬ 构建单细胞基因组 ＭＤＡ 类型文库ꎬ 文库质
