Page 49 - 《广西植物》2020年第12期

ϟ Ꭾ ሕ ࿗ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ԡ 卷
用融合报告基因进行显微观察ᖔ例如ᖔ通过构建融 ϟ঎ϟ঎԰ 试剂জ 限制性内切酶 ̵ᔠႥʐ ᎏܦጛዞᅳ ኏ሙܦఋᑕी

合 ᥈è۪ 表达载体ᖔ 显示辣椒 ྉ ࣷᐹᡓ໧ᔠዞࣩቂ ᐹႥႥࣩࣩቂɯ 酶及 ఋ࿗ ᧕શዶ 连接酶均购自 ఋᑕ᣽ᑕ኏ᑕ 公司ᤥ 蛋白和
۪኏ϟԡ᥋ᓂ኏኏ϟ 复合物的细胞质定位是引发辣椒叶片 ᧕શዶ ᥘᑕʢҴᔀʢ 均购自生工生物工程ྉ 上海ɯ 股份有
细 胞死亡的前提 ྉ ऊၤᆍᔽ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡϟ԰ ɯଫ 鹰嘴豆 限公司ଫାऊዶ 法和 ାʢᑕʛ஦ᆍʢʛ 法蛋白浓度测定试剂
ऊᑕዶା኏ϟऐ 蛋白则是一个具有双重作用模式的细胞 盒购自北京索莱宝科技有限公司ଫ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 电泳

核定位蛋白ᖔ其可通过增加真菌膜的通透性和核 各项试剂均为北京赛驰生物科技有限公司产品ଫ
崩 解 从而发挥抗真菌活性 ྉ ऊၤᑕᡷᡷᔀʢᢼᔀᔀ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 ᧧੫᥈ 抗体购自
԰ԡϟँɯᤥ 此外ᖔ采用免疫胶体金技术显示华东葡萄 北京康为世纪生物科技有限公司ଫ᧕ዶା 显色试剂
ྉႬᔠᡙᔠ໧ ᡓ໧ᓣࣩʐᅳʗᓣᡙᔠዞࣩᤀᐹᡙᐹɯ჆ᡱ۪኏ϟԡ঎԰ 蛋白分布在叶绿 盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司ଫ其他常
体和细胞壁ᖔ从而发挥其酶活性并抵抗病原体的 用试剂为国产分析纯试剂ᤥ
早期入侵ྉ ̀ᔀ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡϟሕɯᤥ 以上结果表明不同 ϓॹԣ 方法
۪኏ϟԡ 蛋白定位于不同细胞器ᖔ进而通过不同的机 ϟ঎԰঎ϟ 原核表达载体 ᡱጶఋ԰ऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 的构建জ 根

制发挥生物学功能ᤥ 据本实验前期克隆获得的盐穗木病程相关蛋白
盐穗木是新疆盐碱环境分布最广泛的建群种 ̵ዞۗቴϟԡ 基因序列ྉ᥈ᔀႿାᑕႿҴ 登录号᧥᣽èᤃᎮሕሕጢᤃɯᖔ
和优势种ᖔ是盐生植物的先锋代表ᖔ有着极强的生 分别设计上游含 ጛዞᅳ ኏ሙܦ下游含 ̵ᔠႥʐ ᎏ限制性
命力 ྉ 郗金标等ᖔ ԰ԡԡᤃଫ ԻᔀႿ੫ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ ԰ԡϟጢ ɯᤥ 内切酶位点的引物ᖔ 上游引物 ̵ዞۗቴϟԡ ጶ۪ϟ᧥ጢࣕ᥋
̵ዞۗቴϟԡྉ ᥈ᔀႿାᑕႿҴ᧥᣽èᤃᎮሕሕጢᤃɯ 是盐穗木中的一个 ዹ੫੫᥈ዶዶఋఋऊዶఋ᥈᥈᥈ఋ᥈ఋዶఋఋఋዶऊዶఋ᥋ሕࣕଫ 下游引 物
盐响应基因ᖔ前期研究发现该基因受到各种非生 ̵ዞۗቴϟԡ ۪̀԰᧥ጢࣕ᥋ᡷ੫ᡷዶዶ᥈ऊఋఋఋऊዶዶ᥈ऊዶఋዶዶዶ᥈ऊఋ᥈
物胁迫诱导且可显著提高转基因植物的耐盐和耐 ዶ᥈᥈᥋ሕࣕྉ下划线表示相应的酶切位点ᖔ小写字母为
旱性ྉ文章未发表ɯᖔ但对其参与生物学功能的机 保护碱基ɯᤥ 以 ᡱᥘ᧕ϟऐ᥋ఋ᥋̵ዞۗቴϟԡ 质粒为模板ᖔ进

制 仍不清楚ᤥ ۪୩ᨃ኏ఋ ྉ ၤᡷᡷᡱ᧥ ᣰ ᣰ ᡱ༁ᆍʢᡷ঎ ၤ੫ዹ঎ ᢼᡱ ᣰ ஦ᆍʢቝ঎ 行 ۪ऊ኏ 扩增ᖔ 用 ϟᠮ 的琼脂糖凝胶电泳检测ᤥ
ၤᡷቝ᤟ɯ在线预测显示盐穗木病程相关蛋白 ̀ዹ۪኏ϟԡ ̵ዞۗቴϟԡ ۪ऊ኏ 产物和 ᡱጶఋ԰ऐᑕ 表达载体双酶切后回
可能定位表达在线粒体基质ܦ细胞质和过氧化物 收ᖔఋ࿗ 连接酶 ϟᤃ ቩ 过夜连接ᖔ将连接产物转化

酶体等亚细胞水平的结构中ᤥ 因此ᖔ本研究通过 ᧕̀ጢም 菌株ᖔ获得的重 组 质 粒 ᡱጶఋ԰ऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 经
构建原核表达载体 ᡱጶఋ԰ऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡᖔ利用大肠杆 双酶切鉴定正确后送生工生物工程ྉ上海ɯ 股份有
菌系统表达并纯化融合蛋白 ̀ᔽ༁᥋̀ዹ۪኏ϟԡᖔ免疫小 限公司测序ᤥ
鼠ᖔ制备效价高ܦ特异性强的盐穗木病程相关蛋白 ϟ঎԰঎԰ 重组蛋白的原核表达ܓ优化及纯化জ 将测序
̀ዹ۪኏ϟԡ 的多克隆抗体ᖔ为 ̀ዹ۪኏ϟԡ 的组织和细胞 正确的重组质粒 ᡱጶఋ԰ऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 转 化 大肠杆菌

定位及生物学功能研究奠定基础ᤥ ାᓂ԰ϟᖔ按照张冀等ྉ԰ԡϟऐɯ 的方法诱导表达目的蛋
白ᖔ将诱前ܦ诱后ܦ诱后上清和诱后沉淀于 ࿗ቩ ᖔ
ϟজ 材料与方法 ϟ԰ ԡԡԡ ʢኼቝᔽႿ ᖔ离心 ԰ቝᔽႿᖔ各取 ԰ԡ Pᓂ 点样ᖔ用
᥋ϟ
ϟጢᠮ ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 检测ᤥ 以可溶性融合蛋白占总蛋
ϓॹϓ 材料和试剂 白含 量 的 百分比为依据ᖔ 对诱导的 ᧧۪ఋ᥈ 浓度
ϟ঎ϟ঎ϟ 实验材料জ 拟南芥为 ऊᆍ᤟ࣼቝᤦᔽᑕ᥋ԡྉ ऊᆍ᤟᥋ԡɯ 生 ྉԡ঎࿗ܦԡ঎Ꭾܦϟ঎ԡ ቝቝᆍ᤟ኼᓂ ɯܦ温度ྉ԰ᎮܦሕϟܦሕᎮ ቩ ɯܦ转
᥋ϟ
态型ᖔ本小组前期通过农杆菌ྉ ዛ੖ʗᅳᤇᐹዞᡙᓣʗᔠࣩቂɯ 介导 速ྉϟऐԡܦ԰ԡԡܦ԰԰ԡ ʢኼቝᔽႿ ɯ和时间ྉ࿗ܦጢܦᤃ ၤɯ 进行
᥋ϟ
的花序浸染法获得了转 ̵ዞۗቴϟԡ 拟南 芥 ᨃጶϟ 和 ࿗ 因素 ሕ 水平正交试验ྉ 表 ϟɯᖔ设计正交分析表
ᨃጶँ 两个纯系植株ᤥ 大肠杆菌 ᧕̀ጢም 和 ାᓂ԰ϟ 感 ྉ表 ԰ɯᖔ分析这 ࿗ 个因素对 ̀ዹ۪኏ϟԡ 重组蛋白可溶
受态细 胞 购 自 北 京全式金生物技术有限公司ᖔ 性的影响ᖔ优化表达体系ᤥ 对正交实验 ँ 组不同
᧕̀ጢም᥋ᡱጶఋ԰ऐᑕ ྉ շ ɯ 和 ᧕̀ጢም᥋ᡱᥘ᧕ϟऐ᥋ఋ᥋̵ዞۗቴϟԡ 为 条件下诱导的蛋白进行 ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 电泳ᖔ并通过

本实验室保存菌种ᤥ ᧧ቝᑕ੫ᔀȮ 对电泳条带进行灰度扫描ᖔ确定 ̀ዹ۪኏ϟԡ 原