Page 51 - 《广西植物》2020年第12期
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ϟ Ꭾ ሕ ᤃ 广জ 西জ 植জ 物 ࿗ԡ 卷
声破碎ᖔ离心取上清液ᖔ用组氨酸标签亲和层析柱
对上清液中的融合蛋白进行纯化ᖔ对诱导前ܦ诱导
后ܦ诱导后上清ܦ诱导后沉淀ܦ纯化的 ̀ᔽ༁᥋̀ዹ۪ϟԡ
蛋白进行 ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 检测ᖔ结果显示在最优条件
下诱导表达后ᖔ诱导的目的蛋白大部分以可溶性
形式存在ᖔ并在纯化后得到分子量大小约为 ጢ Ҵ᧕ᑕ
的目的重组蛋白 ̀ዹ۪ϟԡྉ图 ࿗ɯᤥ 以 ାऊዶ 蛋白定量
᥋ϟ
试剂盒测得纯化蛋白浓度为 ጢԡԡ ဂ੫ኼቝᓂ ᤥ
ԣॹᇺ 多克隆抗体的免疫效价及特异性分析
采用间接 ጶᓂ᧧୩ዶ 法检测抗血清效价ᤥ 将抗血
清用 ϟᠮ ା୩ዶ 封闭 液 按 ϟ ᨒ ϟ ԡԡԡܦ ϟ ᨒ ሕ ԡԡԡܦ
᤹᧕ᓂԡԡԡ ቝᑕʢҴᔀʢଫ ϓ 重组质粒 ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡଫ ԣ 用 ጛዞᅳ
ϟ ᨒ ँ ԡԡԡܦϟ ᨒ Ꭾ ԡԡԡܦϟ ᨒ ऐϟ ԡԡԡܦϟ ᨒ ࿗ሕ ԡԡԡ稀释
ሙ和 ̵ᔠႥʐ ᎏ双酶切重组质粒 ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡᤥ
后进行测定ᖔ结果如图 ጢ᧥ዶ 所示ᤥ 由图 ጢ 可知ᖔ当
᤹ ᧕ᓂԡԡԡ ቝᑕʢҴᔀʢଫ ϓ ᔀዹᆍቝᤦᔽႿᑕႿᡷ ᡱᑕ༁ቝᔽʛ ᆍ ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡଫ
ԣ ᔀዹᆍቝᤦᔽႿᑕႿᡷ ᡱᑕ༁ቝᔽʛ ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ औᑕ༁ ʛᔽ੫ᔀ༁ᡷᔀʛ ᤦᢃ ጛዞᅳ ሙ
抗血清稀释 ࿗ሕ ԡԡԡ 倍时ᖔ小鼠抗血清的光吸收值
ᑕႿʛ ̵ᔠႥʐ ᎏ
图 ϟজ 重组质粒 ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 的双酶切鉴定 与阴性对照相比大于 ϟᖔ即抗血清效价达 ϟᨒ
èᔽ੫ ϟজ ᧧ʛᔀႿᡷᔽᔽዹᑕᡷᔽᆍႿ ᆍ ʢᔀዹᆍቝᤦᔽႿᑕႿᡷ ᡱᑕ༁ቝᔽʛ ࿗ሕ ԡԡԡᖔ表明该抗血清滴度较高ᤥ 以纯化的 ̀ᔽ༁᥋
ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ ᤦᢃ ʛᆍࣼᤦᔀ ʛᔽ੫ᔀ༁ᡷᔽᆍႿ ̀ዹ۪ϟԡ 重组蛋白ܦ野生型及两个转 ̵ዞۗቴϟԡ 基因
拟南芥植株总蛋白为样品进行 ۼᔀ༁ᡷᔀʢႿ ାᆍᡷᡷᔽႿ੫ 鉴
ቝቝᆍኼᓂ ᧧۪ఋ᥈ܦሕᎮ ቩ 诱导温度ܦԡ ʢኼቝᔽႿ 诱导 定ᖔ结果显示纯化的重组蛋白在约 ጢ Ҵ᧕ᑕ 处出现
᥋ϟ
᥋ϟ
转速下进行 ࿗ၤ 初步诱导表达ᖔ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 电泳结 了一条杂交条带ྉ图 ጢ᧥ାɯᖔ两个转 ̵ዞۗቴϟԡ 基因拟
果显示ᖔ与诱导前相比ᖔ经 ᧧۪ఋ᥈ 诱导后 ࿗ 个单克 南芥株系总蛋白在约 ϟऐ Ҵ᧕ᑕྉ图 ጢ᧥ऊɯ 处均出现了
隆均在约 ጢ Ҵ᧕ᑕ 处诱导出一条增强的蛋白条带 与预期分子量大小一致的特异性杂交条带ᖔ而野
ྉ图 ᧥ዶɯᖔ且单克隆间无表达量的差异ᖔ表明该蛋 生型拟南芥总蛋白没有出现杂交条带ᖔ说明制备
白在 ାᓂϟ 大肠杆菌中成功表达ᤥ 对诱导后的蛋 的 ̀ዹ۪ϟԡ 抗血清不仅能与重组的 ̀ᔽ༁᥋̀ዹ۪ϟԡ 蛋
白进行超声破碎ᖔ用 ϟጢᠮ ୩᧕୩᥋۪ዶ᥈ጶ 检测诱导前ܦ 白结合ᖔ而且也能够特异地识别拟南芥中异源表
诱导后ܦ诱导后上清ܦ诱导后沉淀样品ᖔ结果表明 达的 ̀ዹ۪ϟԡ 蛋白ᤥ 效价 高ܦ 特异性强的 ̀ᔽ༁᥋
重组蛋白 ̀ዹ۪ϟԡ 以可溶性和包涵体两种形式存 ̀ዹ۪ϟԡ 融合蛋白抗血清制备成功ᤥ
在ྉ图 ᧥ାɯᤥ
ሕজ 讨论与结论
重组蛋白 ̀ዹ۪ϟԡ 的原核表达优化及纯化জ
为获得大量可溶性 ̀ዹ۪ϟԡ 重组蛋白ᖔ对正交实验
ँ 组不同条件下诱导表达的蛋白超声并进行 ୩᧕୩᥋ 高效的蛋白表达系统是研究蛋白结构ܦ定位
۪ዶ᥈ጶ 检测ᖔ使用 ᧧ቝᑕ੫ᔀȮ 对条带进行灰度扫描ᖔ进 及功能的基础ᤥ 本研究的核心目的是纯化目的蛋
行含量计算和统计学分析ྉ 图 ሕɯᖔ根据数据显示 白ᖔ制备效价高ܦ特异性好的盐穗木病程相关蛋白
可知ᖔँ 组正交实验中第 ऐ 组的可溶性蛋白含量最 ̀ዹ۪ϟԡ 的抗血清ᤥ 大肠杆菌是最常用的原核表
低ᖔ第 ࿗ 组的可溶性蛋白含量最高ᖔ约为第 ऐ 组的 达系统ᖔ具有遗传背景清楚ܦ遗传稳定ܦ表达量高ܦ
ሕጢ 倍ᖔ 因此ᖔ ାᓂϟ᥋ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 菌种在 ᧧۪ఋ᥈ 成本低廉ܦ表达产物易纯化及使用范围广等优点
᥋ϟ
浓度 ԡᎮ ቝቝᆍኼᓂ ܦ温度 Ꭾ ቩ ܦ转速 ԡԡ ʢኼቝᔽႿ ᥋ϟ ྉશࣼዹ ᪲ શࣼዹᖔ ԡԡᤃɯᤥ 此外ᖔ本研究选择 ᡱጶఋऐᑕ
下诱导 ᤃၤ 时表达的可溶性 ̀ዹ۪ϟԡ 重组蛋白量 作为表达载体ᖔ不仅由于其含有高表达目的蛋白
最大ᤥ 在最优条件下对含有 ᡱጶఋऐᑕ᥋̵ዞۗቴϟԡ 重组 的噬菌体 ఋᎮ 启动子ᖔ且其 શ 端和 ऊ 端各有一个可
质粒的菌种进行大量表达ᖔ收集大肠杆菌菌体ᖔ超 编码 ᤃ 个连续 ̀ᔽ༁ 的标签ᖔ方便后续融合蛋白的纯
