Page 50 - 《广西植物》2020年第3期

３ ３ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
实验数据使用 Ｋａｌｐａｎ￣Ｍｅｉｒ 存活曲线分析程序分
表 ２ 分离培养基信息
析ꎬ加样处理组和对照组之间的比较使用 Ｋａｐｌａｎ￣
Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ
Ｍｅｉｅｒ Ｌｏｇ￣ｒａｎｋ 两两比较程序分析ꎮ 使用 Ｇｒａｐｈｐａｄ
培养基 培养基配方 Ｐｒｉｓｍ ７.００ 软件制图表ꎬ通过 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软件进行序
Ｍｅｄｉｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
列整理ꎮ
ＡＧＧ 淀粉 １０ ｇꎬ葡萄糖 １ ｇꎬ甘油 ５ ｍＬ
Ｓｔａｒｃｈ ｓｏｌｕｂｌｅ １０ ｇꎬｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ １ ｇꎬｇｌｙｃｅｒｏｌ ５ ｍＬ
２ 结果与分析
Ｍ４ Ｌ￣天冬酰胺 １ ｇꎬ海藻糖 ５ ｇ
Ｌ￣Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ １ ｇꎬｔｒｅｈａｌｏｓｅ ５ ｇ
Ｍ５ 海藻糖 ５ ｇꎬ脯氨酸 １ ｇ
Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ５ ｇꎬｐｒｏｌｉｎｅ １ ｇ ２.１ 真红树植物内生放线菌多样性分析
Ｍ７ 酵母粉 ５ ｇꎬＬ￣天冬酰胺 １ ｇꎬ甘油 １０ ｍＬ 选择 ７３ 株菌进行 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列比对ꎬ
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ ｇꎬＬ￣Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ １ ｇꎬｇｌｙｃｅｒｏｌ １０ ｍＬ
结果表明 ２４ 株为放线菌ꎬ分布于 １ 个纲 ４ 个目 ７
Ｍ９ 精氨酸 １ ｇꎬＬ￣天冬酰胺 １ ｇꎬ甘油 ６ ｍＬ
Ａｒｇｉｎｉｎｅ １ ｇꎬＬ￣Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ １ ｇꎬｇｌｙｃｅｒｏｌ ６ ｍＬ 个科 １１ 个属ꎬ其多样性分布如表 ３ 所示ꎮ 其中ꎬ有
Ｍ１０ 葡萄糖 １０ ｇꎬ酸水解酪素 ０.５ ｇ ９ 株菌为链霉菌属(Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ)ꎬ占所分离放线菌
Ｇｌｕｃｏｓｅ １０ ｇꎬｃａｓｅｉｎ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ０.５ ｇ
株总数的 ３７.５０％ꎮ 根据放线菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序
Ｐ７ Ｌ￣酪氨酸 ０.５ ｇꎬＬ￣天冬酰胺 １ ｇꎬ甘油 １５ ｍＬ
列相似性小于 ９８.６５％ 的菌株属于潜在新物种的
Ｌ￣Ｔｙｒｏｓｉｎｅ ０.５ ｇꎬＬ￣Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ １ ｇꎬｇｌｙｃｅｒｏｌ １５ ｍＬ
Ｐ３ 燕麦粉琼脂 ２０ ｇ 归类原则( Ｋｉｍꎬ２０１４)ꎮ 菌株 ＩＭＤＧＸ ６２７０ Ｂｒｅｖｉ￣
Ｏａｔｅｍｅａｌ ａｇａｒ ２０ ｇ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.、ＩＭＤＧＸ ６１３７ Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ.和 ＩＭ￣
Ｍ１１ 棉籽糖 ５ ｇꎬＬ￣组氨酸 １ ｇ
Ｒａｆｆｉｎｏｓｅ ｐｅｎｔａｈｙｄｒａｔｅ ５ ｇꎬＬ￣Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ １ ｇ ＤＧＸ ６１７３ Ｌｙｓｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｓｐ.分别与有效发表菌株
ＩＳＰ２ 酵母粉 ２ ｇꎬ麦芽提取物 ２ ｇꎬ葡萄糖 ２ ｇ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｅｒｍｅｎｓｅ、 Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉ￣
Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２ ｇꎬｍａｌｔ ｅｘｔｒａｃｔ ２ ｇꎬｇｌｕｃｏｓｅ ２ ｇ
ｌｕｍ、Ｌｙｓｉｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｐｅｌｏｐｈｉｌｕｍ 的 最 高 相 似 度 为

９７.７２％、９８.１５％、９８.３２％ꎬ可能为潜在的新物种ꎮ
１.２.４ 菌 株 代 谢 产 物 的 提 取 制 备 参 考 覃 媚 等 ２.２ ２４ 株内生放线菌在植物样品、不同植物组织及
(２０１６)的方法ꎬ将 ２４ 株对数生长期的放线菌接种 培养基中的分布
到 ２００ ｍＬ 液体培养基ꎬ于恒温震荡培养箱中发酵 １４ 种植物样品ꎬ９ 种不同分离培养基及 ５ 种
７ ｄꎬ发酵液用等体积乙酸乙酯萃取 ３ 次ꎬ取乙酸乙 (根、茎、叶、花、胚轴)不同植物组织的分布情况如
酯层浓缩干燥后为代谢粗提物ꎮ 将粗提物用０.１％ 图 １－图 ３ 所示ꎮ 从图 １ 可见ꎬ不同植物样品中分
￣１
ＤＭＳＯ 稀释至 １０ ｍｇｍＬ 备用ꎮ 离到的菌株数量变化为 Ｈ４>Ｈ９>Ｈ２>Ｈ３>Ｈ５ ＝ Ｈ７>
１.２.５ 延缓衰老活性测定 参考 Ｂｒｅｎｎｅｒ(１９７４) 的 Ｈ１２>Ｈ１３>Ｈ１ ＝ Ｈ６ ＝ Ｈ１１>Ｈ８ ＝ Ｈ１４>Ｈ１０ꎻ属的分
方法ꎮ 用 Ｍ９ 缓冲液将培养至产卵期的雌雄同体 布依次为 Ｈ４>Ｈ９>Ｈ５ ＝ Ｈ２>Ｈ７>Ｈ３ ＝ Ｈ１２ ＝ Ｈ１３>
秀丽隐杆线虫冲洗 ３ 次ꎬ以 １ ∶ ３ 的比例加入裂解 Ｈ１ ＝ Ｈ６ ＝ Ｈ１１ >Ｈ８ ＝ Ｈ１４ >Ｈ１０ꎮ 由图 ２ 所示ꎬ根、
液 ( １ ｍＬ ５ ｍｏｌ Ｌ 的 ＮａＯＨ 和 ０. ５ ｍＬ ５％ 的 茎、叶、花、胚轴 ５ 种不同植物组织分离得到放线
￣１
ＮａＣｌＯ 混匀)ꎮ 震荡离心后ꎬ置于 ２０ ℃ 生化培养 菌数量大小顺序为叶>茎>胚轴>花>根ꎬ其中叶子

箱中培养 ４８ ｈ 后可得 Ｌ４ 期线虫ꎮ 将培养好的 Ｌ４ 得到 １８ 株放线菌ꎬ隶属于 １０ 个属ꎬ其数量最多且
期线虫挑至已加入溶有待测样品的 ７０ mＬ ＯＰ５０ 多样性最为丰富ꎮ 由图 ３ 可知ꎬ不同培养基分离
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ 的 ＮＧＭ 培养基上进行培养ꎬ每组 ２ 得到的菌株数量趋势为 Ｍ５ >Ｐ７ ＝ Ｍ７ >Ｐ３ ＝ Ｍ４ ＝
板ꎬ每板 ２０ 条ꎬ此时培养天数记为 ０ ｄꎮ 此后ꎬ隔 Ｍ１０>Ｍ９>ＡＧＧ>Ｍ１１ꎻ菌株多样性趋势为 Ｍ５ ＝ Ｍ７>
天对培养基的线虫进行计数ꎬ观察并记录线虫死 Ｐ７>Ｐ３ ＝ Ｍ４ ＝ Ｍ１０ >Ｍ９ >ＡＧＧ>Ｍ１１ꎮ 其中ꎬＭ５ 培
亡数量(在寿命实验期间ꎬ发现线虫对外界刺激没 养基培 养 得 到 的 菌 株 数 量 最 多ꎬ 且 多 样 性 最 为

有应答时视为死亡ꎻ剔除逃离培养基表面而干死、 丰富ꎮ
虫卵在体内孵化而成袋样虫或者钻进培养基内部 ２.３ 真红树植物内生放线菌发酵产物延缓衰老活

的线虫)ꎬ直至线虫全部死亡ꎮ 实验平行 ３ 次ꎮ 性分析
１.３ 统计分析 与空 白 组 [( １６. ９ ± ７. ０６) ｄ] 相 比ꎬ ＩＭＤＧＸ
所有数据采用 ＳＰＳＳ ２２.０ 进行统计分析ꎬ寿命 ６１５７、ＩＭＤＧＸ ６１８２、ＩＭＤＧＸ ６２４８、ＩＭＤＧＸ ６３６０ ４ 个