Page 49 - 《广西植物》2020年第3期

３ 期 姜舒等: 海南西海岸真红树内生放线菌多样性及其延缓衰老活性初筛 ３ ２ ９

响ꎬ以该区域 １４ 种真红树植物为研究对象ꎬ通过
表 １ 样品采集信息
纯化培养技术分离菌株ꎬ利用菌株的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ
因序列分析并鉴定真红树内生放线菌的多样性ꎬ丰
富该海域真红树内生放线菌新物种ꎬ挖掘微生物的 样品编号
Ｃｏｄｅ ｏｆ 植物名称 植物组织
潜在药理活性ꎬ对海洋微生物资源的开发利用具有 ｓａｍｐｌｅ Ｐｌａｎｔ ｎａｍｅ Ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ
重要意义ꎮ
Ｈ１ 桐花树 茎、叶、胚轴
Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
１ 材料与方法 Ｈ２ 红海榄 花、茎、叶、胚轴、根
Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ Ｂｌｏｓｓｏｍꎬ ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ
ｈｙｐｏｃｏｔｙｌꎬ ｒｏｏｔ
１.１ 材料和仪器 Ｈ３ 榄李 茎、叶、胚轴
Ｌｕｍｎｉｔｚｅｒａ ｒａｃｅｍｏｓａ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
１.１.１ 仪器和设备 ＳＷ￣ＣＪ￣２Ｆ 洁净工作台ꎬＨＶＥ￣５
Ｈ４ 白骨壤 花、茎、叶、胚轴
高压灭菌锅ꎬＯＬＹＭＰＵＳ ＳＺＸ １６ 体视镜ꎬＢ１１￣ＢＳ￣Ⅱ Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ Ｂｌｏｓｓｏｍꎬ ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
电热恒温培养箱ꎮ Ｈ５ 桐花树 茎、叶、胚轴、根
Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌꎬ ｒｏｏｔ
１.１.２ 材料和试剂 大肠埃希菌(ＯＰ５０)和野生型秀
Ｈ６ 白骨壤 茎、叶、胚轴
Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
丽隐杆线虫(Ｎ２) 均由广西科学院汪斌博士惠赠ꎮ
Ｈ７ 红海榄 茎、叶、胚轴、根
５％次氯酸钠购于杭州朗索医用消毒剂有限公司ꎻ
Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ｓｔｙｌｏｓａ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌꎬ ｒｏｏｔ
ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 树脂、２×Ｅａｓｙ Ｔａｑ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ 购于美国 Ｂｉｏ￣ Ｈ８ 白骨壤 茎、叶
Ｒａｄ 公司ꎻＰＣＲ 引物(２７Ｆꎬ １４９２Ｒ)购于北京全式金 Ａｖｉｃｅｎｎｉａ ｍａｒｉｎａ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆ
生物技术有限公司ꎻ二甲基亚砜(ＤＭＳＯ) 等其他试 Ｈ９ 木果楝 茎、叶、胚轴、根
Ｘｙｌｏｃａｒｐｕｓ ｇｒａｎａｔｕｍ
Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌꎬ ｒｏｏｔ
剂均为分析纯ꎬ购于西陇科学股份有限公司ꎮ Ｈ１０ 瓶花木 茎、胚轴
１.２ 方法 Ｓｃｙｐｈｉｐｈｏｒａ ｈｙｄｒｏｐｈｙｌｌａｃｅａ Ｓｔｅｍꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌꎬ
Ｈ１１ 桐花树 茎、叶、胚轴
１.２.１ 样本来源与采集 １４ 种真红树植物 ４６ 份植 Ａｅｇｉｃｅｒａｓ ｃｏｒｎｉｃｕｌａｔｕｍ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
物组织于 ２０１７ 年 ７ 月采集于海南西海岸区域的红 Ｈ１２ 红树 茎、叶、胚轴、根
Ｒｈｉｚｏｐｈｏｒａ ａｐｉｃｕｌａｔａ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌꎬ ｒｏｏｔ
树林ꎬ具体信息见表 １ꎮ Ｈ１￣Ｈ７ 真红树植物的地理
Ｈ１３ 木榄 茎、叶、胚轴
位置为１０９°５９′３７″ Ｅ、１９°５５′０７″ ＮꎬＨ８￣Ｈ１４ 的地理 Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ
位置为 １０９°３１′５０″ Ｅ、１９°５１′２６″ Ｎꎮ 菌株载体用 Ｈ１４ 卤蕨 茎、叶
Ａｃｒｏｓｔｉｃｈｕｍ ａｕｒｅｕｍ Ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆ
无菌水冲洗 ３ 次后立即装入密封采样袋ꎬ置于采
样冰盒中ꎬ２４ ｈ 内完成菌株分离ꎮ
１.２.２ 菌 株 的 分 离 纯 化 与 保 藏 参 考 李 家 怡 等 １.２.３ 菌株的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列的系统发育学分
(２０１８)的样品处理方法ꎬ用 ５％次氯酸钠溶液浸泡 析 系统发育学分析基因组 ＤＮＡ 的提取和 ＰＣＲ
８ ｍｉｎꎬ对红树植物各个组织样品进行表面消毒ꎬ无 梯度扩增参照 Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ.(１９９１)的方法进行ꎮ 所
菌水冲洗残余液体ꎻ７５％的酒精溶液浸泡 ５ ｍｉｎꎬ无 有菌株均在 ＩＳＰ２ 培养基上三区划线纯化ꎬ根据菌
菌水冲洗至无酒精味ꎮ 分别取表面消毒后的植物 落形态特征进行初步排重ꎬ不同形态的菌株利用
材料(约 ２ ｇ) 充分研磨ꎬ吸取 ２ ｍＬ 无菌水与样品 Ｃｈｅｌｅｘ￣１００ 树脂法提取菌株 ＤＮＡꎬ１６Ｓ ｒＲＮＡ 基因
充分混匀ꎬ该浓度液体为样品原液ꎬ取 １ ｍＬ 原液 扩增和序列分析ꎮ ＰＣＲ 产物用 １％琼脂糖凝胶电
用无菌水稀释到 １０ 于 ４ ℃ 冰箱暂存ꎮ 取 １０ 组 泳检测ꎬ利用 Ｂｉｏ￣ＲＡＤ 凝胶成像仪观察电泳条带ꎬ
￣４
￣４
织悬 液 ０. ２ ｍＬꎬ 分 别 接 种 于 ＡＧＧ、 Ｍ４、 Ｍ５、 Ｍ７、 检验合格后委托上海美吉生物医药技术有限公司
Ｍ９、Ｍ１０、Ｐ７、Ｐ３、Ｍ１１ ９ 种分离培养基( 表 ２) 中ꎬ 广州分公司进行测序ꎮ 测序结果经 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 软件
于 ２８ ℃ 恒温培养箱培养 ２ ~ ８ 周ꎻ通过颜色、大小、 整理ꎬ利用数据库 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｅｚｂｉｏ￣
形态等指标观察ꎬ挑选不同的菌落在 ＩＳＰ２ 纯化培 ｃｌｏｕｄ.ｎｅｔ/ ) ( Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００９) 进 行 在 线 比 对ꎻ 对
养基上进行三区划线纯化ꎬ直至得到单一纯净的 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列进行相似性比对搜索ꎬ从中选
菌落ꎬ并记录菌落数及菌落的形态特征ꎮ 纯化好的 取相似 性 较 高 且 是 有 效 描 述 的 典 型 菌 株 的 １６Ｓ

菌株制成 ２０％(Ｖ/ Ｖ)甘油管保藏于－８０ ℃ꎮ ｒＲＮＡ 基因序列作为参比对象ꎮ