Page 55 - 《广西植物》2020年第4期

４ 期 李冰怡等: 地黄核苷二磷酸激酶基因的克隆及生物信息学分析 ４ ９ ３

ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｄａｔａ ｏｆ Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ. Ｔｈｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＲｇＮＤＰＫⅠｗａｓ ７６５ ｂｐ. Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙ￣
ｓｉｓꎬ ｗｉｔｈ ａｎ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ４４７ ｂｐꎬ ＲｇＮＤＰＫⅠｅｎｃｏｄｅｓ １４８ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ａｎｄ ｈａｓ ｔｙｐｉｃａｌ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅｓ. Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ＲｇＮＤＰＫⅠｗａｓ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍꎬ
ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｉｏｎ. Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｏｆ
Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ ａｎｄ Ｈａｎｄｒｏａｎｔｈｕｓ ｉｍｐｅｔｉｇｉｎｏｓｕｓꎬ ９７％ ａｎｄ ９６％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. ＮＤＰＫ ｇｅｎｅ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ ｍａｎｙ ｏｒ￣
ｇａｎｉｓｍｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｍａｎｙ ｓｉｍｉｌａｒ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔｓꎬ ｓｏ ｉｔ ｉｓ ｐｒｅ￣
ｓｕｍｅｄ ｔｈａｔ ＲｇＮＤＰＫⅠｉｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒꎬ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＲｇＮＤＰＫⅠ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａꎬ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｋｉｎａｓｅ(ＮＤＰＫ)ꎬ ｓｉｌｉｃｏ ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ

核 苷 二 磷 酸 激 酶 ( ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ 滋阴 清 热、 补 血 止 血 等 多 种 效 用 ( Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ
ｋｉｎａｓｅꎬＮＤＰＫ)广泛存在于生物界ꎬ１９５３ 年 Ｂｕｒｇ 等 ２０１８)ꎮ 本研究从地黄中克隆了核苷二磷酸激酶

人第 一 次 发 现 了 ＮＤＰＫ 蛋 白 ( Ｄｕｍａｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ 基因的全长 ｃＤＮＡ 序列ꎬ并对其进行了相关生物信
１９９２)ꎬ近年来人们对 ＮＤＰＫ 的研究兴趣愈发浓厚 息学分析(郑雪等ꎬ２０１８)ꎬ以期进一步探明地黄核
(Ｂｏｍｉｎａａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９３)ꎮ 研究发现 ＮＤＰＫ 是一种 苷二磷酸激酶的性质、结构及功能ꎬ为研究植物核
进化上非常保守的酶(Ｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎬ能够催化 苷二磷酸激酶的功能及其机制提供理论依据ꎮ
底物磷酸化、维持生物体内核苷酸的代谢平衡 (刘
孟等ꎬ２０１６)ꎬ还可能参与细胞增殖与发育的过程 １ 材料与方法
(Ｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎬ也有研究表明核苷二磷酸激酶

Ａ 表达 量 和 多 种 肿 瘤 转 移 呈 负 相 关 ( 熊 盛 等ꎬ １.１ 材料
２００４)ꎮ 植物核苷二磷酸激酶的研究开始较晚ꎬ自 本研究以地黄 ８５￣５ 长势良好的块根为实验材
从 １９７１ 年 于 豌 豆 中 分 离 得 到 第 一 个 ＮＤＰＫ 后 料ꎬ其栽培于河南师范大学试验田ꎮ 根据电子克
(Ｅｄｌｕｎｄꎬ１９７１)ꎬ已从拟南芥、芒果、水稻、芝麻等 隆法得到的地黄核苷二磷酸激酶基因全长 ｃＤＮＡ
植物中分离出 ＮＤＰＫꎮ 目前研究的植物核苷二磷 序列ꎬ设计扩增目的基因的 ＰＣＲ 引物ꎬＦ:５′￣ＡＴＧ￣

酸激酶主要有 ＮＤＰＫⅠ、ＮＤＰＫⅡ和 ＮＤＰＫⅢ三种ꎬ ＧＡＧＣＡＧＡＣＴＴＴＣＡＴＴＡＴＧ￣３′ꎬ Ｒ:５′￣ＴＣＡＣＴＧＡＴＡＧＡＴ
其中植 物 ＮＤＰＫ Ⅰ 的 含 量 最 高 ( Ｍａｎｉｇｂａｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ ＣＣＡＧＧＡＧＴＧＡＡ￣３′ꎬＰＣＲ 扩增引物由上海生物工程
２０１１)ꎬ占 ＮＤＰＫｓ 总活性的 ７０％以上( 王文斌等ꎬ 公司合成ꎮ 大肠杆菌 Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α 菌种、
２０１１)ꎬ且活性最强(Ｈｅｔｍａｎｎ ＆ Ｋｏｗａｌｃｚｙｋꎬ２００９)ꎬ Ｔ４ 克隆载体购于宝生物工程(大连)有限公司ꎮ
可对多种底物起催化作用ꎬ但对底物有一定的偏 １.２ 试剂
好性ꎬ优先选择利用 ＡＴＰ ( Ｚｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００６)ꎮ 在本研究中ꎬ主要用到以下试剂:反转录试剂
一些研究发现核苷二磷酸激酶是一种高度保守的 盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)ꎬ琼脂糖、溴化
多功能蛋白ꎬ能够参与植物的多种代谢调节过程 乙锭(四川维克奇生物科技有限公司)ꎬ引物( Ｉｎ￣
(孙小洁和王增兰ꎬ２０１２)ꎬ包括植物生长发育、非 ｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司)ꎬ 胶 回 收 试 剂 盒、 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ( ＤＬ
生物胁迫、感病应激、光合作用和能量代谢等( 朱 ２ ０００)(宝生物生物技术公司)ꎬ上样缓冲液为 ６×

馨妮等ꎬ２０１７)ꎮ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ、２×Ｔａｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(北京康为世纪生
地黄 ( Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ) 为 玄 参 科 ( Ｓｃｒｏ￣ 物科技有限公司) 等ꎬ其他常规试剂均为国产分
ｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ)地 黄 属 ( Ｒｅｈｍａｎｎｉａ) 多 年 生 草 本 植 析纯ꎮ
物ꎬ其新鲜 或 干 燥 根 块 茎 可 入 药 ( 药 典 委 员 会ꎬ １.３ 方法
２０１０)ꎮ 全国各地都有种植地黄ꎬ尤其以怀地黄药 １.３.１ ＲＮＡ 的提取及反转录 以地黄 ８５￣５ 的成熟
效最佳ꎬ具有增强免疫、抗病毒、降血糖、抗氧化、 块 根 为 实 验 材 料ꎮ 首 先ꎬ 通 过 Ｔｒｉｚｏｌ 法 提 取 总