Page 56 - 《广西植物》2020年第4期
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４ ９ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
ＲＮＡꎬ用 ＤＮａｓｅ / ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ 处理ꎬ酚 － 氯仿抽提 去 ｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ / ) 分 析
除 ＤＮａｓｅꎬ乙醇沉淀回收 ＲＮＡ( 孙鹏等ꎬ２００８)ꎮ 然 ＲｇＮＤＰＫⅠ编码蛋白的信号肽ꎬ并利用 ＣＢＳ 数据库中
后ꎬ通过微量分光光度计检测 ＲＮＡ 的 ２６０ ｎｍ / ２８０ 的 ＴａｒｇｅｔＰ 预测ＲｇＮＤＰＫⅠ编码蛋白的亚细胞定位ꎮ
ｎｍ 及其 ＲＮＡ 的浓度ꎬ并采用琼脂糖凝胶电泳检测 另外ꎬ通过 ＮＣＢＩ 的 ＣＤＤ 分析ＲｇＮＤＰＫⅠ编码蛋白的
ＲＮＡ 的完整性ꎮ 结构域ꎬ利用 ＳＯＰＭＡ (ｈｔｔｐ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｂｉｌ. ｉｂｃｐ. ｆｒ/ ｃｇｉ￣
本 实 验 利 用 ＨｉＳｃｒｉｐｔ Ⅱ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｂｉｎ/ ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ)预测了
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 反转录试剂盒进行地黄 ｃＤＮＡ 的制 ＲｇＮＤＰＫⅠ编码蛋白的二级结构ꎬ同时采用 ＳＷＩＳＳ￣
备ꎬ按照说明书的操作进行实验以合成 ｃＤＮＡ 第 ＭＯＤＥＬ ( ｈｔｔｐ:/ / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ/ ｗｏｒｋｓｐａｃｅ/
一链ꎮ ｉｎｄｅｘ.ｐｈｐ? ｆｕｎｃ＝ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ＿ｓｉｍｐｌｅ１＆ｕｓｅｒｉｄ ＝ＵＳＥＲＩＤ ＆
１.３.２ 目的基因的克隆 电子克隆是在已建立的 ｔｏｋｅｎ＝ＴＯＫＥＮ)同源建模方法对ＲｇＮＤＰＫ Ⅰ编码蛋
核酸序列与蛋白质序列数据库的基础上ꎬ利用计 白进行在线 ３Ｄ 结构预测ꎮ
算机技术与生物信息学工具进行快速比对、拼接
及分析从而获得基因的部分乃至全长 ｃＤＮＡ 序列 ２ 结果与分析
(葛春艳等ꎬ２０１８)ꎮ 本研究以地黄 ８５￣５ 六个发育
时期的组合块根所转录出的 ＲＮＡ 总和为材料进 ２.１ 地黄ＲｇＮＤＰＫ Ⅰ基因的克隆
行转录组测序ꎬ采用 ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序平台 本研究利用地黄的转录组学数据ꎬ通过电子
进行测序ꎬ通过 ｂｌａｓｔ 与其他公共数据库进行同源 克隆 法 得 到 地 黄 核 苷 二 磷 酸 激 酶 基 因 的 全 长
性比对ꎬ获得基因功能的注释( 王向楠ꎬ２０１７)ꎮ 利 ｃＤＮＡ 序列ꎬ 然 后 在 ＣＤＳ 区 设 计 引 物ꎬ 以 地 黄 的
用电子克隆的方法得到目的基因 ｃＤＮＡ 全长ꎬ然后 ｃＤＮＡ 第一链为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ琼脂糖凝胶
在 ＣＤＳ 区设计引物ꎬ以地黄的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ采用 电泳检测结果表明扩增片段长 ７５０ ｂｐ 左右( 图
ＰＣＲ 技术克隆得到核苷二磷酸激酶的全长 ｃＤＮＡ １)ꎬ与预期结果相符ꎮ
序列ꎮ
ＰＣＲ 扩增反应条件如下:首先ꎬ９５ ℃ 预变性 ３
ｍｉｎꎻ然后ꎬ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ４７ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延
伸 ３０ ｓꎬ共 ３５ 个循环ꎻ最后ꎬ７２ ℃ 总延伸 １０ ｍｉｎꎮ
ＰＣＲ 产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测ꎬ所得产物
进行胶回收并连接到 ｐＭＤｌ９￣Ｔ 载体上ꎬ然后转化
Ｅ.ｃｏｌｉ ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ涂布于添加氨苄青霉素
(１００ ｍｇＬ )、ＩＰＴＧ、Ｘ￣ｇａｌ 的 ＬＢ 平板上ꎬ３７ ℃ 培
￣１
养 １２ ~ １６ ｈ 后进行蓝白斑筛选及菌落 ＰＣＲ 检测ꎬ
阳性克隆送至金唯智生物技术有限公司测序ꎮ
１.３. ３ 生 物 信 息 学 分 析 本 研 究 通 过 ｂｌａｓｔｐ 对
Ｍ. ２ ０００ ｍａｒｋｅｒꎻ １. 目的片段ꎮ
ＲｇＮＤＰＫ Ⅰ基因编码的氨基酸序列进行相似性搜 Ｍ. ２ ０００ ｍａｒｋｅｒꎻ １. Ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ.
索ꎬ并利用 ＭＥＧＡ７.０ 和 ｂｌａｓｔｎ 构建其系统进化树ꎮ 图 １ ＲｇＮＤＰＫ Ⅰ基因的 ＰＣＲ 扩增
使用 ＤＮＡＭＡＮ 分析ＲｇＮＤＰＫ Ⅰ编码蛋白的相对 Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲｇＮＤＰＫⅠｇｅｎｅ
分子质量、等电点及其同源蛋白的多序列比对ꎮ
测序结果表明目的基因的全长 ｃＤＮＡ 序列为
通 过 ＥＸＰＡＳＹＰＲＯＴＳＣＡＬＥ (ｈｔｔｐ:/ / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ/
ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ )、 ＴＭＨＭＭ ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ/ ７６５ ｂｐꎬＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 分析得知其开放阅读框(ＯＲＦ)
ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ/ )分别分析ＲｇＮＤＰＫⅠ编码蛋白的疏 位于第 １２５ ~ ５７１ 个核苷酸ꎬ长度为 ４４７ ｂｐꎬ编码
水性及其跨膜区ꎬ采用 ＥＸＰＡＳＹＳｉｇｎａｌＰ ４.０Ｓｅｒｖｅ (ｈｔ￣ １４８ 个氨基酸 ( 图 ２) ꎮ ＩＮＴＥＲＰＲＯＳＣＡＮ 和 ＣＤＤ
