Page 73 - 《广西植物》2020年第4期

４ 期 樊航等: 西番莲 ＰｅＥＲＧ 基因克隆及其表达模式分析 ５ １ １

程中发挥重要作用ꎮ 州省平塘县西番莲种质资源库(１０６°４８′４５.４４″ Ｅ、
植物 ＥＲＧ 蛋白定位于线粒体或叶绿体ꎬ它们 ２５°４４′２４.７７″ Ｎꎬ海拔 ８８４ ｍ)ꎬ其不同组织器官根、
在植物的生长发育过程中扮演重要角色(Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ 茎、叶、花、果(Ｒ、Ｓ、Ｌ、Ｆｌ、Ｆｒ) 采集于 ２ 年生的大田
ａｌ.ꎬ １９９８ꎻ Ｓｕｗａｓｔｉｋａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４ꎻ Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ 扦插苗ꎮ 盆栽的 １ 年生扦插苗ꎬ用于 ４ ℃ 低温胁
２０１８)ꎮ 迄今ꎬ还没有木本植物 ＥＲＧ 基因克隆和 迫及 ２５ ℃ 常温恢复试验ꎬ并在其低温胁迫 ０ ｈ( 对

功能验证的相关报道ꎮ 西番莲抗寒新品种‘ 平塘 １ 照)、１ ｈ( ＬＳＴ￣１ｈ)、４ ｈ( ＬＳＴ￣４ｈ)、８ ｈ( ＬＳＴ￣８ｈ)、２４
号’ꎬ经受过 ２００８ 年中国南方雪凝冰冻极端天气 ｈ(ＬＳＴ￣２４ｈ)、７２ ｈ(ＬＳＴ￣７２ｈ) 及其放置于常温恢复

的考验ꎬ是目前选育出的唯一能在贵州喀斯特山 １ ｈ( ＮＴＲ￣１ｈ)、４ ｈ( ＮＴＲ￣４ｈ)、８ ｈ( ＮＴＲ￣８ｈ)、２４ ｈ
区不经任何保暖防护措施而在零下温度条件能顺 (ＮＴＲ￣２４ｈ)、７２ ｈ(ＮＴＲ￣７２ｈ)１１ 个时间点取其叶片
利越冬的西番莲新种质ꎮ 课题组前期开展了西番 用于目的基因在低温胁迫及常温恢复过程中的表
莲抗 寒 性 状 的 分 子 调 控 模 式 研 究 ( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ 达谱分析ꎮ 所用三个生物学重复的上述样品经液
２０１７)ꎬ差异基因表达谱分析发现ꎬＥＲＧ 基因参与 氮速冻后保存于－８０ ℃ 超低温冰箱备用ꎮ
调控西番莲低温应答响应ꎮ 本研究以此为切入 １.２ 总 ＲＮＡ 提取与 ｃＤＮＡ 合成
点ꎬ通过 ＲＡＣＥ 技术克隆西番莲 ＥＲＧ 基因ꎬ开展该 采用天根生物科技( 北京) 有限公司提供的

基因编码蛋白质序列的同源性比对、保守结构域 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ( ＴＩＡＮＧＥＮꎬ北京) 抽提纯
及系统进化分析ꎬ并利用实时定量 ＰＣＲ 平台检测 化植物总 ＲＮＡꎬ并用宝生物工程( 大连) 有限公司
该转录本在低温胁迫条件下的动态变化模式ꎬ为 的 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ(ＴａＫａＲａꎬ大连)进行
ＴＭ
深入揭示 ＥＲＧ 基因在植物生长发育和逆境应答响 反转录合成 ｃＤＮＡ 用于后续基因表达分析ꎮ
应中的生物学功能提供新思路ꎮ １.３ ｃＤＮＡ 末端快速克隆(ＲＡＣＥ)
根据实验室前期研究获得的候选基因 ｕｎｉｇｅｎｅ
１ 材料与方法 序列(Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎬ设计 ＰＣＲ 引物( 表 １)ꎬ以
‘平塘 １ 号’ 叶片 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ开展候选基因片
１.１ 植物材料及低温胁迫试验 段的 ＰＣＲ 扩增和测序验证ꎮ 基于测序验证获得的

西番莲抗寒新品种‘平塘 １ 号’ 材料来自于贵 基因片段序列设计 ＲＡＣＥ 特异引物 (表 １)ꎬ 按照
表 １ 引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ

引物名称 正向引物(５′￣３′) 反向引物(５′￣３′)
Ｐｒｉｍｅｒ＿ＩＤ Ｆｏｒｗａｒｄ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ(５′￣３′) Ｒｅｖｅｒｓｅ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ(５′￣３′)
ＰｅＥＲＧ＿基因片段 ＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＡ ＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＴＡＧ
ＰｅＥＲＧ ＿Ｕｎｉｇｅｎｅ
ＰｅＥＲＧ＿３ 外引物 ＣＣＧＡＴＡＡＧＣＡＣＡＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣ ＡＣＴＣＴＧＣＧＴＴＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧ
ＰｅＥＲＧ ＿３ＯＵＴＥＲ
ＰｅＥＲＧ＿３ 内引物 ＡＴＧＡＡＧＡＡＴＧＴＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＧ ＧＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡＧ
ＰｅＥＲＧ ＿３ＩＮＮＥＲ
ＰｅＥＲＧ＿５ 外引物 ＧＣＧＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＴＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＡＡ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ
ＰｅＥＲＧ ＿５ＯＵＴＥＲ
ＰｅＥＲＧ＿５ 内引物 ＣＡＡＣＡＡＡＡＧＧＧＡＣＧＧＣＴＡＣＧＡＡ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
ＰｅＥＲＧ ＿５ＩＮＮＥＲ
开放阅读框 ＡＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＴＴＴＡＡＡＣＧＴＣＴＣ ＴＡＡＴＧＣＴＧＣＧＡＴＴＴＴＣＣＣＴＣ
ＰｅＥＲＧ ＿ＯＲＦ
ＰｅＥＲＧ 定量引物 ＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＴＡＧＣＧＡＧＣ ＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＧＴＣＣＴＣＴＴＣ
ＰｅＥＲＧ ＿ｑＲＴ￣ＰＣＲ
内参基因定量引物 ＴＧＧＧＣＣＧＡＴＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡ ＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＡＧＧＣＴＣＣＣＡＡＣＴＧ
ｅＩＦ￣５Ａ＿ｑＲＴ￣ＰＣＲ