Page 74 - 《广西植物》2020年第4期
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５ １ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
蛋白质分子量、理论等电点、氨基酸组成以及疏水
性ꎮ 蛋白质二级结构、三级结构、跨膜区、信号肽、
亚细胞定位分别采用 ＳＰＯＭＡ、ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ、ＴＭ￣
ＨＭＭ 、ＳｉｇｎａｌＰ 和 Ｃｅｌｌ￣Ｐｌｏｃ２.０ 工具进行ꎮ 序列多
重比对使用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ２ 软件ꎮ 系统进化树构建采
用 ＭＥＧＡ７ 软件中的邻接( Ｎｅｉｇｈｂｏｒ ＪｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ) 法
进行构建ꎮ
１.５ 实时定量 ＰＣＲ
以来源于不同组织和不同时长低温胁迫材料
的 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬ 使 用 Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试剂(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ美国)ꎬ在
ＶｉｉＡ ７ 平台上开展目的基因实时定量 ＰＣＲ 检测ꎮ
每个样品三次技术重复ꎬ以 ｅＩＦ￣５Ａ 为内参( 表 １)ꎬ
－ΔΔＣｔ
采用 ２ 法进行相对表达量分析ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 西番莲 ＰｅＥＲＧ 基因 ｃＤＮＡ 全长序列分析
经 ３′￣ＲＡＣＥ 和 ５′￣ＲＡＣＥ 巢式 ＰＣＲ 扩增、测序
拼接及其 ＯＲＦ 预测与测序验证ꎬ最终获得目的基
因全长 ｃＤＮＡ 序列ꎻ经 ＮＣＢＩ 数据库 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ
该基因与其他植物 ＥＲＧ 基因有较高同源性ꎬ故将
其命名为 ＰｅＥＲＧꎮ 西番莲 ＰｅＥＲＧ 基因 ｃＤＮＡ 全长
为 １ ５１８ ｂｐꎬ 包 括 ３８ ｂｐ 的 ５′￣端 非 翻 译 区 ( ５′￣
ＵＴＲ) 和 ２２０ ｂｐ 的 ３′￣端 非 翻 译 区 ( ３′￣ＵＴＲ)ꎬ 其
ＯＲＦ 长度为 １ ２６０ ｂｐ (图 １)ꎮ ＰｅＥＲＧ 基因在 ３９ ~
４１ 位为起始密码子 ＡＴＧꎬ下游存在同框终止密码
图 １ 西番莲 ＰｅＥＲＧ 基因核酸和氨基酸序列
子 ＴＧＡ 和 ｐｏｌｙＡ 尾ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＰｅＥＲＧ ｉｎ Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ ｅｄｕｌｉｓ ＰｅＥＲＧ 基因编码 ４２０ 个氨基酸ꎬ预测其编码
蛋白质的相对分子量( ＭＷ) 为 ４７.５７ ｋＤꎬ理论等
ＴＭ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ 操作指南
ＳＭＡＲＴｅｒ 电点(ｐＩ)是 ５.５３ꎻ带负电荷残基总数 ( Ａｓｐ＋Ｇｌｕ)
进行 ３′￣ＲＡＣＥ 和 ５′￣ＲＡＣＥ 巢 式 ＰＣＲ 扩 增ꎬ 并 经 为 ６７ 个ꎬ带正电荷残基总数( Ａｒｇ＋Ｌｙｓ) 为 ５８ 个ꎻ
ＰＣＲ 产物回收、连接、转化、测序和拼接ꎬ预测其开 不稳定指数( ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎｄｅｘ) 为 ３８.３５ꎬ属于稳定
放阅读框( ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬ ＯＲＦ)ꎮ 最后设计 蛋白ꎻ总平均亲水性(ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ ｏｆ ｈｙｂｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙꎬ
ＯＲＦ 扩增引物( 表 １)ꎬ 完成 ＯＲＦ 的 ＰＣＲ 扩增和 ＧＲＡＶＹ)为－０.４３１ꎬ预测该蛋白是亲水性蛋白ꎮ 蛋
测序验证ꎮ 白质亲疏水性序列谱见图 ２:ＡꎬＰｅＥＲＧ 蛋白质同
１.４ 生物信息分析 时具有疏水性和亲水性区域ꎬ且亲水性氨基酸残
ＢｉｏＥｄｉｔ 软 件 用 于 ３′￣ＲＡＣＥ 和 ５′￣ＲＡＣＥ 序 列 基明显多于疏水性氨基酸残基ꎮ 亲水区域最高值
比 对 拼 接ꎬ ＯＲＦ 预 测 借 助 于 ＦＧＥＮＥＳＨ 软 件ꎮ (Ｓｃｏｒｅ ＝ －３.５００) 出现在第 ８６ ~ 第 ９１ 个氨基酸残
Ｅｘｐａｓｙ Ｐｒｏｔｐａｒｍａ 和 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 在线程序用于分析 基ꎬ 疏水区域的最高值 (Ｓｃｏｒｅ ＝ ２.６８９) 出现在第
