Page 70 - 《广西植物》2020年第7期
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９ ６ ６ 广 西 植 物 ４０ 卷
表 １ 克隆 ＦｍＰＨＶ 基因编码区对应引物 １.２.４ 实时荧光定量对水曲柳不同部位及瞬时侵染
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｄｉｎｇ 植株中 ＦｍＰＨＶ 和相关基因表达量分析 以水曲柳
ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ＦｍＰＨＶ ｇｅｎｅ
微管 蛋 白 基 因 Ｔｕ 作 为 内 参 基 因 ( Ｌｉｖａｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ
引物名称 引物序列
２００１)ꎬ引 物 见 表 ２ꎮ ＰＣＲ 反 应 体 系 如 下: １０ μＬ
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘꎬ２ μＬ 模板 ｃＤＮＡꎬ１０ μｍｏｌＬ 的正反向
￣１
ＦｍＰＨＶ￣Ｆ ５′￣ＴＧＣＴＴＴＡＣＡＡＴＡＣＡＡＡＡＴＣＧＣ￣３′
ＦｍＰＨＶ￣Ｒ ５′￣ＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＡＡＣＣ￣３′ 引物各 １ μＬꎬ用 ｄｄＨ Ｏ 补足至 ２０ μＬꎮ 扩增反应利
２
用 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００ 荧光定量 ＰＣＲ 仪进行ꎬ反
应程序: ９５ ℃３０ ｓ、９５ ℃５ ｓ、６０ ℃ ３４ ｓ(共 ４０ 个循
性等理化性质进行分析( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ /
ｐｒｏｔｐａｒａｍ / 、ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / )ꎮ 使 环)、９５ ℃１５ ｓ、６０ ℃１ ｍｉｎ、９５ ℃１５ ｓꎮ 每份样品进
用在线分析软件对 ＦｍＰＨＶ 蛋白的跨膜结构域进 行 ３ 次重复ꎮ 目标基因表达水平运用相对定量的
－ΔΔＣｔ (Ｌｉｖａｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００１)进行计算ꎬ式中: Ｃｔ 是热循
行 分 析 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｅｍｂｎｅｔ. ｖｉｔａｌ￣ｉｔ. ｃｈ / ｓｏｆｔｗａｒｅ / ２
ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ.ｈｔｍｌ)ꎮ 利用 ＷＯＬＦ￣ＰＳＯＲＴ 在线软 环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值ꎮ
件对 ＦｍＰＨＶ 蛋白的亚细胞定位情况进行预测分
析(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ / )ꎮ 利用 ＮＣＢＩ 数据库 ２ 结果与分析
Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｓｅａｒｃｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ( ＣＤ Ｓｅａｒｃｈ) 在线
分析 软 件 分 析 ＦｍＰＨＶ 的 保 守 结 构 域ꎮ 使 用 ２.１ ＦｍＰＨＶ 基因全长克隆与序列分析
ＭＥＧＡ７.０.２ 软件的 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ( ＮＪ) 算法对其 以水曲 柳 实 生 苗 全 株 的 ｃＤＮＡ 为 模 板 进 行
他物种中同源性较高的 ＰＨＶ 蛋白构建系统发育 ＰＣＲ 反应扩增ꎬ获得一条大小为２ １００ ｂｐ 左右的
进化树ꎮ 利用在线多序列比对软件 ＰＲＡＬＩＮＥ 对 片段ꎬ扩增结果见图 １ꎮ 经测序ꎬ通过 ＮＣＢＩ 数据库
ｂｌａｓｔｎ 比对ꎬ确定获得水曲柳 ＰＨＶ 基因序列ꎬ并命
不同物种的 ＰＨＶ 结构域进行多重序列比对ꎮ
１.２.３ 水曲柳外植体无菌材料的获得 选择并收集 名为 ＦｍＰＨＶꎮ ＦｍＰＨＶ 基因的开放阅读框全长为
２ １１２ ｂｐꎬ编码了 ７０３ 个 氨 基 酸 ( 图 ２)ꎮ 经 过 比
一年生或多年生水曲柳茎条ꎮ 截剪长度为 ４ ~ ６ ｃｍ
的茎段在流水下冲洗 ２ ~ ４ ｈꎬ将清洗过的组织放无 对ꎬ与油橄榄( Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ) ＯｅＡＴＨＢ１４ 基因核苷
菌烧 瓶 中ꎬ ７５％ 乙 醇 以 及 ５％ 的 次 氯 酸 钠 ( 日 本 酸序列(ＸＭ＿０２３０１１０３８.１) 的一致性为 ９９％ꎻ与芝
Ｊｕｎｓｅｉ)对外植体消毒ꎮ 材料接种于 ＭＤ２０１ 培养基 麻(Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ) ＳｉＡＴＨＢ１４ 基因核苷酸序列
(ＷＰＭ＋４.０ ｇＬ 琼脂＋２０ ｇＬ 蔗糖＋１ ｍｇＬ 毒 (ＸＭ＿０１１０９８３７６.２) 的一致性为 ９９％ꎻ与烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
￣１
￣１
￣１
￣１ ｔａｂａｃｕｍ) ＮｔＰＨＶ 基因核苷酸序列 ( ＪＱ６８６９３２.１)
莠定＋１ ｍｇＬ ６￣ＢＡ)ꎬ并于黑暗条件培养 ７ ｄꎮ
表 ２ 克隆关键基因荧光定量 ＰＣＲ 引物
Ｔａｂｌｅ ２ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｋｅｙ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ＲＴ￣ｑＰＣＲ
引物 正向引物序列 反向引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＦｍＴＵ ５′￣ＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＣＡＡＣＡＡＣＴＴＴ￣３′ ５′￣ＴＴＧＡＧＧＧＧＡＡＧＧＧＴＡＡＡＴＡＧＴＧ￣３′
ＦｍＰＨＶ￣ｑ ５′￣ＣＧＧＡＴＡＡＧＣＡＡＡＡＣＴＧＧＧＧＧＴ￣３′ ５′￣ＡＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＴＴＡＴＴＣＡ￣３′
ＦｍＲＥＶ￣ｑ ５′￣ＣＧＧＴＴＡＣＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＴＡＣ￣３′ ５′￣ＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＧＣＡＴＴＴＧ￣３′
ＦｍＡＨＰ￣ｑ ５′￣ＧＴＡＡＧＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＣＡ￣３′ ５′￣ＴＣＡＧＡＧＴＴＡＣＡＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＣＣ￣３′
ＦｍＹＵＣ￣ｑ ５′￣ＣＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴ￣３′ ５′￣ＣＧＡＡＣＡＧＡＣＣＣＴＣＧＧＣＡＡＧＴＡ￣３′
ＦｍＺＰＲ３￣ｑ ５′￣ＧＣＡＧＴＧＣＴＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＧＧＴＴ￣３′ ５′￣ＡＴＧＧＡＧＡＧＧＣＴＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＧ￣３′
ＦｍＥＳＲ２￣ｑ ５′￣ＧＧＣＴＴＧＧＡＡＣＴＴＴＴＧＡＣＡＣＧ￣３′ ５′￣ＴＧＡＡＧＣＴＡＴＡＣＧＡＡＣＧＧＡＣＡＡＧ￣３′
ＦｍＷＩＮＤ１￣ｑ ５′￣ＴＧＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＧＡＴＣＴＡＡＡ￣３′ ５′￣ＣＴＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＡＣＧＡＡＡ￣３′
