Page 69 - 《广西植物》2020年第7期
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７ 期             张佳薇等: 水曲柳 ＦｍＰＨＶ 基因克隆及在形成层愈伤组织中的表达分析                                        ９ ６ ５

   可以直接调控生长素生物合成基因 ＹＵＣ５ 和生长                          曲柳胚性细胞培养相关研究甚少ꎬ所以本研究以
   素的转运方向ꎬ且可以直接与在维管系统发育中                             树皮为主要研究对象ꎬ对形成层细胞进行分离培
   起主 要 作 用 的 ＭＯＮＯＰＴＥＲＯＳ / ＡＵＸＩＮ ＲＥＳＰＯＮＳＥ            养ꎬ获得兼具优良扩繁能力的形成层细胞ꎮ 同时
   ＦＡＣＴＯＲ５(ＭＰ / ＡＲＦ５)启动子相互作用ꎬＨＤ￣ＺＩＰ Ⅲ                对芽再生过程中关键转录因子 ＦｍＰＨＶ 在不同月
   通过激活 ＭＰ 的表达ꎬ进而稳定维管系统内生长素                          份、不同组织部位以及在形成层愈伤组织中的表
   状 态ꎬ 以 确 保 维 管 细 胞 的 正 确 形 成 和 分 化                达情况ꎬ为形成层愈伤胚性诱导及水曲柳 ＦｍＰＨＶ

   (Ｒｅｉｎｈａｒｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１３ꎻＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１４ꎻＭｕｌｌｅｒ ｅｔ  功能的深入研究提供参考ꎮ
   ａｌ.ꎬ２０１６ꎻＲｕｏｎａｌａ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１７)ꎮ 进一步说明 ＨＤ￣
   ＺＩＰ Ⅲ转录因子家族成员参与了生长素和细胞分                           １  材料与方法
   裂素网络ꎬ并与其中各关键组分相互作用ꎮ
       ＨＤ￣ＺＩＰ Ⅲ转录因子的表达受 ＷＵＳＣＨＥＬ￣ＲＥ￣                  １.１ 实验材料来源与处理
   ＬＡＴＥＤ ＨＯＭＥＯＢＯＸ１２３５ ( ｗｏｘ１２３５ / ＷＯＸ２ 蛋 白 复             水曲柳材料取自东北林业大学实验林场ꎬ以
   合体)的调控ꎬＷＯＸ２ 通过上调 ＨＤ￣ＺＩＰ Ⅲ转录因                      成熟水曲柳植株树皮以及种子萌发所获得的 ３０ ｄ
   子的表达ꎬ促进细胞分裂素的积累ꎬ进而提高 Ｂ 型                          幼苗为实验材料ꎬ根、茎、叶取自水曲柳 ３ 年生盆
   ＡＲＡＢＩＤＯＰＳＩＳ ＲＥＳＰＯＮＳＥ ＲＥＧＵＬＡＴＯＲｓ ( ＡＲＲｓꎬ包          栽苗ꎬ５ 月—９ 月水曲柳全株(包括根ꎬ茎ꎬ叶) 及雄

   括 ＡＲＲ１、ＡＲＲ２、ＡＲＲ１０ 和 ＡＲＲ１２)的表达(Ｚｈａｎｇ ｅｔ            花雌花取自野生水曲柳用于基因定量测定ꎮ 对水
   ａｌ.ꎬ２０１７)ꎮ Ｂ 型 ＡＲＲｓ 作为细胞分裂素信号通路                   曲柳树皮进行消毒后ꎬ置于 ４ ℃ 中ꎬ使用 ５０ ｍｇ
   中的转录激活因子ꎬ可以通过与 ｍｉｃｒｏＲＮＡ１６５ / ６ 靶                  Ｌ ＩＢＡ 高渗溶液进行 ２０ ｈ 处理后ꎬ放入诱导培养
                                                       ￣１
   向 ＨＤ￣ＺＩＰ Ⅲ转录因子结合ꎬ空间激活 ＷＵＳ 表达ꎬ                     基培养两周后ꎬ获得水曲柳形成层愈伤组织ꎮ 将
   影响干细胞 分 化 ( Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１４ꎻＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ        材料至于液氮中冷冻保存ꎮ
   ２０１７)ꎮ 同时 ＨＤ￣ＺＩＰ Ⅲ蛋白作为茎尖分生组织分                     １.２ 实验方法
   化命运的主要调节因子ꎬ起到维持茎尖分生组织                             １.２.１ ＦｍＰＨＶ 基因编码区全长的克隆  使用 ＣＴＡＢ

   结构并建立侧器官(Ｓａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１８)ꎮ ＨＤ￣ＺＩＰ Ⅲ              方法提取水曲柳组培苗总 ＲＮＡꎮ 经反转录获得
   表达模式与拟南芥芽再生过程中生长素的分布和                             ｃＤＮＡꎮ 实验前期对水曲柳转录组测序获得水曲

   运输方向基本一致( Ｕｒｓａｃｈｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１４ꎻＢａｉｍａ ｅｔ            柳转录组数据库ꎮ 应用 ＢｉｏＥｄｉｔ 软件中 Ｌｏｃａｌ ｂｌａｓｔ
   ａｌ.ꎬ２０１４)ꎮ 可见ꎬＨＤ￣ＺＩＰ Ⅲ转录因子家族在干细                   功能中的 ｂｌａｓｔｎ 和 ｂｌａｓｔｘ 功能ꎬ比对分析确认 ＰＨＶ

   胞龛的重建以及芽再生过程中的重要作用ꎮ 前人                            基因序列并设计引物ꎬ对 ＰＨＶ 编码区全长序列进
   研究表明ꎬＲＥＶ 作用于分生组织侧向位置以激活                           行克隆(引物如表 １ 所示)ꎮ 使用 Ｏｍｅｇａ 胶回收试
   分生组织表达( Ｏｔｓｕｇａ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００１)ꎬ而 ＰＨＢ、ＰＨＶ             剂盒 对 特 异 性 扩 增 产 物 进 行 回 收 纯 化ꎬ 使 用
   存在单突变体表型不易被观察的特点( Ｊｉａ ｅｔ ａｌ.ꎬ                     ｐＥＡＳＹ￣Ｔ５ 载 体 连 接 特 异 产 物ꎬ 转 化 克 隆 进 入
   ２０１５)ꎬ个体基因功能研究甚少ꎮ 但 ＰＨＢ、ＰＨＶ 基                     Ｔｒａｎｓ￣Ｔ１ 感受态细胞中ꎮ 送至生工生物工程( 上
   因与 ＲＥＶ 发挥部分重叠功能( Ｐｒｉｇｇｅꎬ ２００５)ꎮ 所                 海)公司测序ꎮ

   以本研究对 ＦｍＰＨＶ 基因进行了克隆ꎬ探究 ＦｍＰＨＶ                      １.２.２ ＦｍＰＨＶ 基因编码区序列的生物信息学分析
   在水曲柳中的表达特性ꎮ                                         用 ＮＣＢＩ 在 线 工 具 中 的 Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ
       目前关于水曲柳植株离体再生体系的研究包                           ( ＯＲＦ ) Ｆｉｎｄｅｒ 预 测 ＦｍＰＨＶ 基 因 的 编 码 区
   括对成熟胚子叶( Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１３)ꎬ不成熟胚子                  (ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｏｒｆｆｉｎｄｅｒ / )ꎮ 使 用
   叶( Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１２)ꎬ水曲柳顶芽、腋芽的茎段                  ＳｉｇｎａｌＰ５.０ 在线分析软件对 ＦｍＰＨＶ 蛋白进行信号
   (Ｌｉꎬ２００７)ꎬ休 眠 芽 ( Ｔａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００２) ꎬ离 体 叶 片       肽的预测和分析( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/
   (Ｇｕꎬ２０１０) 为外植体进行离体培养ꎬ进而实现不                        ＳｉｇｎａｌＰ / )ꎮ 利用 ＥｘＰＡＳｙ 中 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 工具对该蛋
   定芽离体再生ꎮ 但是对于具有良好扩繁能力的水                            白理论等电点 ｐＩ(ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔ)值、亲水性 / 疏水
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