Page 79 - 《广西植物》2020年第8期
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１ １ ３ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
带常绿阔叶林ꎬ保存较为完好( 王峥峰等ꎬ２０００ꎻ叶 １９９９)ꎬ在引物前后随机添加若干碱基ꎬ组合成不
万辉等ꎬ２００８)ꎮ 叶片 Ｎ ∶ Ｐ 反映了土壤氮磷的相 同引物ꎬ对用于选择性扩增引物进行筛选ꎬ通过聚
对有效性ꎬ当 Ｎ ∶ Ｐ>１６ 时ꎬ则表现为 Ｐ 限制( 刘兴 丙烯酰胺凝胶电泳共筛选出 ６ 对符合实验条件的
诏等ꎬ２０１０)ꎮ 由于地处南亚热带地区ꎬ鼎湖山大 引物对ꎬ用于选择性扩增( 表 １):Ｅ３ / Ｈ￣Ｍ２、Ｅ５ / Ｈ￣
样地受高温多雨的气候条件影响ꎬ土壤风化和土 Ｍ２、Ｅ６ / Ｈ￣Ｍ１、Ｅ８ / Ｈ￣Ｍ１、Ｅ８ / Ｈ￣Ｍ５、Ｅ９ / Ｈ￣Ｍ２ꎮ 扩
壤 Ｐ 流失状况严重ꎬ造成该地区土壤 Ｐ 缺乏( 邵宜 增产 物 送 至 广 州 艾 基 生 物 技 术 有 限 公 司 利 用
晶等ꎬ２０１７) 导致该地区叶片 Ｎ ∶ Ｐ 普遍高于 ２０ꎬ ＨｉＳｅｑ２５００ 平台进行高通量测序ꎮ
证明存在低 Ｐ 限制( Ｈｅｄｉｎꎬ ２００４)ꎮ 此外ꎬ莫江明 １.２ 环境数据信息
等(２０００)通过研究鼎湖山南亚热带常绿阔叶林中 该研究中土壤环境及物种信息均来自鼎湖山
植物营养元素含量的分配格局ꎬ发现磷对南亚热 大样地的长期监测数据ꎮ 研究对象锥所在小样方
带常绿阔叶林植物生产力起最主要的限制作用ꎮ 的土壤理化性质、地形因子来源于 ２００５ 年样方建
锥(Ｃａｓｔａｎｏｐｓｉｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)ꎬ壳斗科锥属ꎬ常绿阔 立时测量的数据ꎬ该研究分析使用的土壤有效磷
叶乔木ꎮ 雌雄同株ꎬ风媒传粉ꎬ根据鼎湖山站的物 数据(ａｐꎬ ｍｇｋｇ )经过 ２０１４ 年最新的土样分析
￣１
候记录ꎬ鼎湖山锥的花期为 ３ 月—４ 月ꎬ果期为 ５ 校正(Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ
月—１１ 月ꎮ 锥在鼎湖山大样地中的重要值排位第 １.３ 数据处理
一ꎬ是森林生态系统中的重要建群种ꎬ对群落构建 (１)利用 ＦａｓｔＱＣ ０.１１.７ 软件(ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｂｉｏｉｎ￣
及生 物 多 样 性 维 持 具 有 重 要 意 义 ( 叶 万 辉 等ꎬ ｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｂａｂｒａｈａｍ.ａｃ.ｕｋ / ｐｒｏｊｅｃｔｓ/ ｆａｓｔｑｃ / )对测序后
２００８)ꎮ 目前对锥的研究主要集中在种子萌发与 得到的原始数据进行质量检验ꎬ通过 ＦＡＳＴＸ＿Ｔｏｏｌｋｉｔ
扩散(杨期和等ꎬ２００５ꎻ杜彦君等ꎬ２００６)、种群动态 软件(ｈｔｔｐ:/ / ｈａｎｎｏｎｌａｂ.ｃｓｈｌ.ｅｄｕ / ｆａｓｔｘ＿ｔｏｏｌｋｉｔ/ ) 去除
(彭少麟和方炜ꎬ１９９５ꎻ张咏梅等ꎬ２００３) 及遗传分 低质量及重复序列ꎬ去除低质量的 ｒｅａｄｓꎬ使用 ｆａｓｔｑ＿
化(王峥峰等ꎬ２００１ꎻ刘孟等ꎬ２０１７) 等方面ꎬ研究地 ｑｕａｌｉｔｙ＿ ｆｉｌｔｅｒ 命 令ꎬ 设 置 最 小 质 量 阈 值 ( Ｍｉｎｉｍｕｍ
点多集中于鼎湖山ꎬ但对其受环境胁迫因子影响 Ｑｕａｌｉｔｙ Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ) 为 ３３ꎬ 最 小 长 度 ( Ｍｉｎｉｍｕｍ
下的分子响应机制研究仍较为缺乏ꎮ 本研究利用 Ｌｅｎｇｔｈ)为 ８０ꎻ去除重复序列ꎬ使用ｆａｓｔｘ＿ｃｏｌｌａｐｓｅｒ命
高通量测序技术结合生物信息学分析手段ꎬ为锥 令ꎬ默认参数ꎮ (２)对质控后所得的序列利用 Ｓｔａｃｋｓ
自制遗传模板序列ꎬ并探寻其对土壤限制性因子 软件 ( ｈｔｔｐ:/ / ｃａｔｃｈｅｎｌａｂ. ｌｉｆｅ. ｉｌｌｉｎｏｉｓ. ｅｄｕ / ｓｔａｃｋｓ/ ) 中
磷的响应基因和这些基因所涉及的生物学功能以 的 ｐｒｏｃｅｓｓ＿ｒａｄｔａｇｓ 命令根据 ｂａｒｃｏｄｅ 序列进行样本
及参与的代谢途径ꎬ以期为群落生态学中受环境 拆分ꎬ再利用 ｄＤｏｃｅｎｔ 软件(ｈｔｔｐ:/ / ｄｄｏｃｅｎｔ.ｃｏｍ/ ａｓ￣
影响产生的分子进化机制提供理论依据ꎮ ｓｅｍｂｌｙ / )进行序列拼接ꎮ (３) 利用 Ｂｏｗｔｉｅ２ 软件ꎬ将
个体序列信息比对到拼接的模板序列上( ｈｔｔｐ:/ /
１ 材料与方法 ｂｏｗｔｉｅ￣ｂｉｏ. ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ. ｎｅｔ/ ｂｏｗｔｉｅ２ / ｉｎｄｅｘ. ｓｈｔｍｌ )ꎮ
(４) 环 境 因 子 与 个 体 基 因 序 列 的 相 关 性ꎬ 利 用
１.１ ＤＮＡ 提取和 Ｆ￣ＭＳＡＰ 实验 ＳＰＳＳ１９.０ 软件进行 Ｐｅｒｓｏｎ 相关分析ꎬ筛选显著相关
样品采自鼎湖山大样地ꎬ共采集 ３８１ 个锥个 基因(Ｐ<０.０５)ꎮ (５)利用 Ｒ ３.４.２ 对所得基因利用
体样品ꎬ每个体取不同部位新鲜叶片ꎬ利用改良的 已有模式植物拟南芥基因注释信息数据库进行比
ＣＴＡＢ 法进行 ＤＮＡ 提取ꎮ 利用 Ｈａｐ Ⅱ、Ｍｓｐ Ｉ 与 对ꎬ完成 ＧＯ 功能注释及 ＫＥＧＧ 代谢通路富集分析ꎮ
ＥｃｏＲ Ｉ 对基因组 ＤＮＡ 进行双酶切ꎻ再将酶切产物
连上接头ꎬ设计并筛选引物进行预扩增ꎬ利用荧光 ２ 结果与分析
标记的引物进行选择性扩增ꎮ 该实验参考刘孟等
(２０１７)的锥 Ｆ￣ＭＳＡＰ 扩增优化体系ꎮ 在 ＥｃｏＲ Ｉ、 ２.１ 模板序列拼接
Ｈｐａ Ⅱ / Ｍｓｐ Ｉ 通 用 引 物 的 基 础 上 ( Ｘｉｏｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ 原始测序数据经过质量过滤及样本拆分后ꎬ
