Page 111 - 《广西植物》2020年第9期

１ ３ ２ ６ 广 西 植 物 ４０ 卷
产 ＮＨ 阳性反应(王刚等ꎬ２００９)ꎮ
３ 表 １ 接种菌剂的处理
１.４ 菌株的鉴定
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎｏｃｕｌｕｍ
１.４.１ 培养特征的观察 将菌株 ＹＢ￣０７ 采用平板
划线法接种于 ＮＡ 培养基中ꎬ２８ ℃ 培养 １ ~ ２ ｄꎬ观 菌株编号 接种量处理
菌株处理 Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ
Ｃｏｄｅ ｏｆ
察并记录单菌落特征ꎮ Ｓｔｒａｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ
ｓｔｒａｉｎ
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￣１
(２.０×１０ 个ｍＬ )
１.４.２ 生理生化鉴定 将菌株 ＹＢ￣０７ 进行革兰氏
染色、甲 基 红 测 定、Ｖ￣Ｐ 测 定、淀 粉 水 解、 吲 哚 试 Ｎ１ Ｎ￣０２ １.２ ｍＬ
验、油脂水解和明胶水解试验ꎮ 试验测定及初步 Ｎ２ Ｎ￣０１ １.２ ｍＬ
鉴定参考« 微生物学实验» 的方法( 蔡信之和黄君 Ｎ３ ＹＢ￣０７ １.２ ｍＬ
Ｐ１ ＮＰ￣０１ １.２ ｍＬ
红ꎬ２０１０)ꎮ
１.４.３ １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列测定及系统发育树分析 测 Ｐ２ ＮＰ￣０２ １.２ ｍＬ
Ｐ３ ＮＰ￣０３ １.２ ｍＬ
定初筛菌的促生能力后ꎬ选择具有多种促生效应
的优 势 菌 株 ＹＢ￣０７ 进 行 鉴 定ꎮ 对 菌 株 ＹＢ￣０７ Ｎ＋Ｐ 混合菌剂 １: Ｎ￣０２、ＮＰ￣０１ ０.６、０.６ ｍＬ
Ｍｉｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇｅｎｔ １: Ｎ￣０２ꎬ
１６Ｓ ｒＤＮＡ基因 片 段 进 行 ＰＣＲ 扩 增 和 测 序ꎬ 获 得 ＮＰ￣０１
ＧｅｎＢａｎｋ 登录号后ꎬ运用 ＭＥＧＡ ６.０６ 软件ꎬ选用邻 ＰＹ 混 合 菌 剂 ２: ＹＢ￣０７、 ＹＢ￣０８、 ０.３、０.３、０.３、０.３ ｍＬ
ＹＢ￣０９、ＹＢ￣１０
接法( Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ) 构建系统发育树ꎬ分析菌 Ｍｉｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇｅｎｔ ２: ＹＢ￣０７ꎬ
ＹＢ￣０８ꎬ ＹＢ￣０９ꎬ ＹＢ￣１０
株的系统发育学特征( 张磊等ꎬ２０１７ꎻ张苗苗等ꎬ ＮＰＹ 混合菌剂 ３: Ｎ￣０１、Ｎ￣０２、ＮＰ￣０１ ０.４、０.４、０.４ ｍＬ
Ｍｉｘｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｇｅｎｔ ３: Ｎ￣０１ꎬ
２０１７)ꎮ Ｎ￣０２ꎬ ＮＰ￣０１
１.５ 盆栽试验 ＣＫ 空白对照 １.２ ｍＬ 无菌水
Ｂｌａｎｋ ｃｏｎｔｒｏｌ １.２ ｍＬ ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ
１.５.１ 小麦种子处理 采用小麦( 品种为陕优 ２２５
号)进行盆栽试验ꎬ将陕优 ２２５ 小麦种子先用冷水
１.５.４ 接种处理 每次选取 ５ 粒饱满、大小均匀的
预浸泡 ４ ~ ６ ｈꎬ捞出后再用 ５２ ~ ５５ ℃ 温水浸泡 １ ~
小麦种子进行播种ꎬ５ 个播种点均匀分布ꎬ种子离
２ ｍｉｎꎬ使种子温度达到 ５０ ℃ ꎬ捞出后放入 ５６ ℃
土表面 ３ ~ ５ ｃｍꎮ 每个处理设 ３ 个重复ꎬ自然光照
温水中ꎬ浸泡 ５ ｍｉｎ 取出ꎬ用凉水冷却后晾干播种ꎮ
１.５.２ 促生菌株间亲和性测试 采用划线接种的 下培养ꎮ 在种子催芽过程中ꎬ每周每个处理每次
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方法测试菌株之间是否存在拮抗作用ꎮ 将待测的 接种浓度为 ２.０×１０ 个ｍＬ 的菌悬液 １.２ ｍＬꎬ同
促生菌株分别两两交叉接种于 ＰＤＡ 培养基上ꎬ放 时对照 组 接 种 等 量 的 无 菌 水ꎬ 土 壤 湿 度 保 持 为
入恒温箱中ꎬ２８ ℃ 培养 ２ ~ ３ ｄꎮ 若两两交叉划线 ６０％ꎮ １５ ｄ 后测定小麦苗子的株高、根长、鲜重、
处菌株能够正常生长ꎬ则菌株间无拮抗作用ꎬ说明 叶绿素含量等指标ꎬ并做统计学分析ꎮ
可以制作复合菌悬液进行试验ꎮ
１.５.３ 接种菌剂的制备 将选取的促生菌菌株接 ２ 结果与分析
种于 ＬＢ 液体培养基中ꎬ在 ２５ ℃ 、１８０ ｒｍｉｎ 的条
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２.１ 菌株的筛选
件下培养 ４８ ｈꎮ 各取培养物装入 ３ ｍＬ 离心管中ꎬ
１０ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ加入生理 用多种不同的培养基ꎬ从巨菌草根部样品中
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盐水 １ ｍＬ 制备成菌悬液ꎬ并按表 １ 的设计方法 经分离、纯化共获得 １０１ 株菌株ꎬ分别测定促生能
(多菌混合组ꎬ包括:固氮、溶磷混合组ꎻ溶磷、产 力后ꎬ从中筛选出促生效果好的 １１ 株菌株进行后
续的促生试验ꎮ 其中有 ８ 株具有产氨能力ꎬ６ 株具
ＩＡＡ 混合组ꎻ固氮、溶磷与产 ＩＡＡ 混合组) 处理后ꎬ
分别取 １.２ ｍＬ(２.０ × １０ 个ｍＬ ) 接种于灭菌后 有溶磷能力ꎬ３ 株具有产 ＩＡＡ 能力(表 ２)ꎮ
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的 ＬＢ 液体培养基中ꎬ于 ２８ ℃ 、１６０ ｒｍｉｎ 下培养 ２.２ 促生能力的测定
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通过试验分别测定了 １１ 株促生能力较强菌株
２ ~ ３ ｄꎬ可获得菌株接种剂ꎮ