Page 110 - 《广西植物》2020年第9期
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９ 期 邓振山等: 巨菌草根部促生菌的筛选及其促生效应 １ ３ ２ ５
ｄｄＨ Ｏ 涂布到同样的培养基上用于检测根部样品
２
１ 材料与方法 的表面消毒是否彻底(王志勇和刘秀娟ꎬ２０１４)ꎮ
１.２.２ 促生菌株筛选 将表面消毒彻底的巨菌草
１.１ 材料 根部样品截成约 １ ｃｍ 的小段ꎬ将根段放入筛选培
１.１.１ 巨菌草根部样品的采集及前期处理 巨菌 养基中(培养基包括 ＰＤＡ 培养基、产 ＩＡＡ 培养基、
草根部样品从延安大学翠园巨菌草示范基地采 Ａｓｈｂｙ 培养基和解磷培养基等)ꎬ于(２８±１)℃ 恒温
集ꎬ用五点采样法ꎬ选择生长性状良好、无病害症 静置培养 ３ ~ ５ ｄꎮ 待培养基中有可见菌落时ꎬ挑取
状的健康巨菌草植株体根部样品 ８０ 个ꎬ用灭菌袋 周围菌落移入相应培养基纯化ꎬ并进行菌落形态
包装带回实验室ꎮ ４ ℃ 低温保藏ꎬ４８ ｈ 内处理完ꎮ 描述、编号和置于 ４ ℃ 冰箱中备用ꎮ 将最后一次
１.１.２ 盆栽试验土壤来源及处理 用于盆栽试验 冲洗的无菌水涂布于培养基上作为对照ꎬ于恒温
的土壤采自延安大学的后山ꎬ采集完成后ꎬ灭菌袋 静置培养ꎬ检验表面消毒是否彻底ꎮ
装好带回实验室ꎮ 用筛子(５ ｍｍ) 筛除土壤中大 １.３ 促生能力的测定
颗粒的土壤、沙石、植物根和未完全腐烂的落叶、 １.３.１ 紫外分光光度计法测定吲哚乙酸含量 将
枝条等杂质ꎮ 处理后的土壤装入塑料盆中待用 筛选获得的菌株接入 ＰＤＡ 培养基中ꎬ在 １８０ ｒ
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(塑料盆直径 １２ ｃｍ)ꎬ每盆装入土壤 １.５ ｋｇꎬ待用ꎮ ｍｉｎ 、２８ ℃ 的条件下摇床培养 ４８ ｈꎮ 培养后各取
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１.１.３ 供试培养基 (１) ＬＢ 培养基:蛋白胨 １０ ｇꎬ ３ ｍＬ 的菌液ꎬ１０ ０００ ｒｍｉｎ 离心 ８ ｍｉｎꎬ取离心好
ＮａＣｌ １０ ｇꎬ酵母膏 ５ ｇꎬ蒸馏水 １ ０００ ｍＬꎬｐＨ７. ０ꎮ 的上清液 １ ｍＬꎬ并加入 ２ ｍＬ 的 Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ’ ｓ (１０.８
(２)ＰＤＡ 培养基:马铃薯 ２００ ｇꎬ葡萄糖 ２０ ｇꎬ琼脂 ｍｏｌＬ Ｈ ＳＯ 含 ４.５ ｇ 的 ＦｅＣｌ ) 反应液ꎮ 在暗处
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２
４
３
１５~２０ ｇꎬ蒸馏水 １ ０００ ｍＬꎬ自然 ｐＨꎮ (３) 阿须贝 静置混合反应 ３０ ｍｉｎꎮ 测定 ＯＤ ５４０ ｎｍ 的值ꎬ使用标
(Ａｓｈｂｙ) 培养基:葡萄糖或甘露醇 １０.０ ｇꎬＫＨ ＰＯ 准品绘制标准曲线ꎮ 将测得的数值代入标准曲线
２ ４
０.２ ｇꎬ ＭｇＳＯ ７Ｈ Ｏ ０. ２ ｇꎬ ＮａＣｌ ０. ２ ｇꎬ ＣａＳＯ 获得产吲哚乙酸的含量ꎮ 用去离子水作为对照处
４ ２ ４
２Ｈ Ｏ ０.１ ｇꎬＣａＣＯ ５.０ ｇꎬ琼脂 １５ ~ ２０ ｇꎬＨ Ｏ １ ０００ 理(田宏等ꎬ２００５)ꎮ
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ｍＬꎬｐＨ７. ０ꎮ ( ４) 解 磷 细 菌 培 养 基: ＮａＣｌ ０. ３ ｇꎬ １.３.２ 钼蓝比色法测定处理液中的磷含量 分别
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ＭｇＳＯ ７Ｈ Ｏ ０.３ ｇꎬＭｎＳＯ ４Ｈ Ｏ ０.０３ ｇꎬＫＣｌ ０.３ 取配置好的 ５０ μｇｍＬ 的含磷标准液各 ０、０.５、
４ ２ ４ ２
ｇꎬ ( ＮＨ ) ＳＯ ０. ５ ｇꎬ ＦｅＳＯ ７Ｈ Ｏ ０. ０３ ｇꎬ １.０、１.５、２.０、２.５、３.０、３.５、４.０ ｍＬꎬ分别置于 ２０ ｍＬ
４ ２ ４ ４ ２
Ｃａ (ＰＯ ) ５. ０ ｇꎬ蔗糖 １０ ｇꎬ琼脂 １５ ~ ２０ ｇꎬ Ｈ Ｏ 具塞试管中ꎬ分别先加蒸馏水至 ６ ｍＬꎬ再加入 １
３ ４ ２ ２
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１ ０００ ｍＬꎬｐＨ７.０~７.５ꎮ (５)ＮＡ 培养基:牛肉膏 ３ ｇꎬ ｍｏＬＬ 的硫酸溶液 ２ ｍＬ、２ ｍＬ 铁钼酸试剂ꎬ混
蛋白胨 １０ ｇꎬＮａＣｌ ５ ｇꎬ蔗糖 １０ ｇꎬ琼脂 １５ ｇꎬ蒸馏水 匀ꎮ 静置 １５ ｍｉｎ 以 后ꎬ用 比 色 皿 在 分 光 光 度 计
１ ０００ ｍＬꎬｐＨ７.０ꎮ (６) 产 ＩＡＡ 培养基:ＫＨ ＰＯ ０.５ ＯＤ 波长处测定吸光度ꎮ 用所得数据绘制标准
２ ４ ６６０ ｎｍ
ｇꎬ酵母膏 １ ｇꎬ甘露醇 １０ ｇꎬＭｇＳＯ ０.２ ｇꎬＮａＣｌ ０.１ ｇꎬ 曲线ꎬ根据测出的吸光度通过标准曲线方程计算
４
色氨酸 １００ ｍｇꎬ蒸馏水 １ ０００ ｍＬꎬｐＨ６.８~７.２ꎮ 待测样品溶液的磷含量(张祥胜ꎬ２００８)ꎮ
１.２ 方法 １.３.３ 产氨能力的测定 将待测菌株接种到 ＮＡ 培
１.２.１ 样品的表面消毒 首先将巨菌草根部用自 养基中ꎬ置于 １８０ ｒｍｉｎ 、２８ ℃ 的条件下摇床培
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来水将附着在根部样品表面的残留土冲洗干净ꎬ 养 ４８ ｈꎬ取 １００ μＬ / ５ ｍＬ 接种于阿须贝液体培养
用吸水纸吸干根部表面的水ꎮ 接着将根部样品浸 基中ꎬ以接种无菌水为对照ꎬ每处理 ３ 个重复ꎬ置
泡在浓度为 ７５％ 的乙醇中ꎬ浸泡 ２ ~ ３ ｍｉｎꎬ无菌 于 ２８ ℃ 恒温下培养ꎬ７ ｄ 后观察对比试验组与对
ｄｄＨ Ｏ 冲洗 ３ 次ꎬ灭菌的吸水纸吸干后ꎬ将根部样 照组的浑浊情况ꎬ明显浑浊的为阳性ꎬ即为有固氮
２
品浸泡在浓度为 ０.１％的 ＨｇＣｌ 溶液中ꎬ浸泡时间 活性(王娜娜ꎬ２０１０ꎻＺａｈｏｏｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 另将待
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为 ３ ｍｉｎꎬ取出立即用无菌 ｄｄＨ Ｏ 冲洗 ６ 次ꎬ确保 测菌株接入蛋白胨(１０ ｇＬ ) 培养液的试管中ꎬ
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消毒剂的无残留ꎮ 最后将最后一次冲洗的无菌 加入 ０.５ ｍＬ Ｎｅｓｓｌｅｒ’ｓ 试剂ꎬ出现黄褐色沉淀的为
