Page 67 - 《广西植物》2020年第9期

１ ２ ８ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷
ｌｏｗｓ: ＲｇＣ３Ｈ ｇｅｎｅ ｗａｓ １ ５３０ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ５０９￣ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ５７.９１ ｋＤ ａｎｄ
ｗｉｔｈｏｕｔ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅꎻ Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｉｔｓ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ＲｇＣ３Ｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｏｎｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏ￣
ｍａｉｎ￣ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｄｏｍａｉｎꎬｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｉｔ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ ｆａｍｉｌｙꎻ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ＲｇＣ３Ｈ ｈａｄ ｈｉｇｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃ３Ｈ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ ａｎｄ Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ ｇｕｔｔａｔａ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｌａｉｄ ａ ｆｏｕｎｄａ￣
ｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＲｇＣ３Ｈ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙ ｏｆ ｖｅｒｂａｓｃｏｓｉｄｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｒｅｈｍａｎｎｉａ ｇｌｕｔｉｎｏｓａꎬ Ｃ３Ｈ ｇｅｎｅꎬ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇꎬ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ

地黄是“ 四大怀药” 之一ꎬ属于玄参科地黄属 列:ＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＣＣＧＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧ
多年生草本植物ꎬ是一种重要的传统中药药材ꎬ种 ＡＣＡＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＧＧＧＧＡＣＣＧＡＴＴＡＴＣＧＧＣＴＡＣＴ

类繁多ꎬ具有益阴生津、清凉热血等功效ꎮ 目前ꎬ ＴＣＣＧＴＴＣＧＧＧＴＣＡＧＧＡＣＧＧＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＣＣＧＧＴ
有关地黄的基因不断被挖掘和分析ꎬ如地黄纤维 ＧＣＡＣＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＧＴＧꎮ ＲｇＣ３Ｈ 基 因
素合酶基因( 周延清等ꎬ２０１５)、ＲｇＴＰＩ 基因( 邵露 引 物 序 列 为 ( Ｆ: ５′￣ＡＴＧＧＣＴＡＴＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＡＴ￣
营等ꎬ２０１８)、ＲｇｈＢＮＧ 基因( 张喻ꎬ２０１４) 等ꎬ但明 ３′ꎬＲ: ５′￣ ＧＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＡＴＡ￣３′)ꎬ 引 物
确相应功能的基因并不多ꎮ 序列合成于英潍捷基(上海) 贸易有限公司ꎮ 琼脂

香豆 酸￣３￣羟 化 酶 ( ｐ￣ｃｏｕｍａｒａｔｅ ３￣ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅꎬ 糖、溴化乙锭( 四川维克奇生物科技有限公司)ꎬ
Ｃ３Ｈ)属于细胞色素 Ｐ４５０ 中的 ＣＹＰ９８ 亚家族ꎬ细 ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ(ＤＬ２ ０００)(宝生物生物技术公司)

胞色素 Ｐ４５０ 参与木质素中间物的生物合成过程 １.２ 方法
中ꎬ在植物生长发育过程中发挥重要作用( 贺丽虹 １.２.１ 目的基因 ＲｇＣ３Ｈ 全长 ＣＤＳ 的获取 依据地
等ꎬ２００８)ꎮ 目前ꎬＣ３Ｈ 基因已在拟南芥( Ｓｃｈｏｃｈ ｅｔ 黄代谢组学分析侯选 ＫＥＧＧ 通路挖掘出 ＲｇＣ３Ｈ 酶
ａｌ.ꎬ２００１)、慈竹( 周美娟等ꎬ２０１２)、苎麻( 袁有美 (Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎬ并在 ＮＣＢＩ 数据库中下载与
等ꎬ２０１７)等植物中逐步被鉴定ꎮ Ｃ３Ｈ 是毛蕊花糖 地黄亲缘关系较近物种的已知 Ｃ３Ｈ 的核苷酸序列

苷等多种物质生物合成途径中的一条共有途径－ 进行同源比对ꎬ获得 Ｃ３Ｈ 部分保守序列ꎮ 找到地
苯丙素途径中的一个限速酶ꎬ地黄转录组测序挖 黄相关的 ＳＲＡ 数据库在 Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂｌａｓｔ 中输入已
掘出其 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ( Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１７)ꎬ地黄代谢组 知的部 分 序 列ꎬ 选 择 高 度 相 似 的 序 列 检 索 地 黄
分析 挖 掘 出 Ｃ３Ｈ 及 其 催 化 途 径 ( Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ＳＲＡ 数据库进行电子克隆ꎮ 用 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 软件预
２０１８)ꎮ 其与毛蕊花糖苷合成相关的作用被初步 测 ＲｇＣ３Ｈ 的 完 整 ＯＲＦｓꎬ 利 用 软 件 ｐｒｉｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒ
证实(Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１７)ꎮ 但是ꎬ地黄全长 Ｃ３Ｈ 基 ５.０ 设计用于 ＲＴ￣ＰＣＲ 的引物ꎬ并以温 ８５ － ５ 块根
因的克隆及生物信息学分析尚未见报道ꎮ 本研究 的 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬＲＴ￣ＰＣＲ 反 应 体 系 参 照 王 向 楠

基于地黄代谢组分析挖掘的 Ｃ３Ｈꎬ采用同源克隆、 (２０１７)ꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ 程序为 ９５ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ９５
电子克 隆 技 术 结 合 ＲＴ￣ＰＣＲ 的 方 法 首 次 获 得 了 ℃ 变性 ３０ ｓꎬ引物退火温度为 ５３ ℃ ꎬ退火时间为

ＲｇＣ３Ｈ 全长 ＣＤＳꎬ并对其碱基序列及其编码的蛋 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸时间 ２ ｍｉｎꎬ３５ ｃｙｃｌｅꎻ７２ ℃ 终延伸
白质序列进行了生物信息学分析ꎬ为进一步研究 １０ ｍｉｎꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ 结束后ꎬ进行 １％ 琼脂糖凝胶电
其在地黄毛蕊花糖苷途径中的作用及其他功能的 泳检测ꎮ 产物胶回收后送至上海金唯智公司进行

开发应用奠定理论基础ꎮ 测序得到 ＲｇＣ３Ｈ 基因的编码序列ꎮ
１.２.２ ＲｇＣ３Ｈ 的生物信息学分析 将测序得到的
１ 材料与方法 ＲｇＣ３Ｈ 完整 ＣＤＳ 区ꎬ用 ＮＣＢＩ 在线分析工具 ＯＲＦ

Ｆｉｎｄｅｒ 查找该基因开放阅读框 ＯＲＦꎻ用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ
１.１ 材料 对 ＲｇＣ３Ｈ 蛋白进行理化性质分析ꎻ用 ＴＭＨＭＭ ２.０
地黄品种温 ８５－５ 块根ꎬ种植于河南师范大学 和 ＮｅｔＰｈｏｓ ３.１ Ｓｅｒｖｅｒ 对 ＲｇＣ３Ｈ 蛋白质的跨膜区和
实 验 田ꎮ 获 得 的 ＲｇＣ３Ｈ 基 因 部 分 保 守 序 磷酸位点进行预测分析ꎻ应用 Ｓｉｇｎａｌ Ｐ￣５.０ 对地黄