Page 68 - 《广西植物》2020年第9期
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９ 期 周延清等: 地黄 Ｃ３Ｈ 基因的克隆及生物信息学分析 １ ２ ８ ３
ＲｇＣ３Ｈ 氨 基 酸 序 列 进 行 信 号 肽 的 分 析ꎮ 用 (ＮＭ＿００１３０４４１０.１)]、猴面花[ Ｅｒｙｔｈｒａｎｔｈｅ ｇｕｔｔａｔａ
ＳＯＰＭＡ 及 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 分 别 对 ＲｇＣ３Ｈ 蛋 白 的 (ＸＭ ＿ ０１２９７２６２５. １ )]、 桃 儿 七 [ Ｓｉｎｏｐｏｄｏｐｈｙｌｌｕｍ
二级和三级结构进行分析ꎮ 用 ＮＣＢＩ 的 ＣＤ ｓｅａｒｃｈ ｈｅｘａｎｄｒｕｍ( ＫＣ１１０９８９. １ )]、 美 花 烟 草 [ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
和 ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ 对 ＲｇＣ３Ｈ 蛋白的结构域进行分析ꎮ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ(ＸＭ＿００９７６６６５０. １)] 等物种的相似性分
利用 ＮＣＢＩ 在线工具 Ｂｌａｓｔ 查找与 ＲｇＣ３Ｈ 同源性较 别依次为 ９１％、８２％、７２％和 ７０％(图 ３)ꎮ
高的序列ꎬ运用软件 ＤＮＡＭＡＮ６.０ 进行同源性分析 为进一步研究 ＲｇＣ３Ｈ 在其他植物之间的进化
及采用 ＭＥＧＡ ６.０ 软件构建系统进化树ꎮ 关系ꎬ利用 ＭＥＧＡ ６.０ 进行 Ｃ３Ｈ 蛋白系统进化树
的构建结果显示ꎬ芝麻、猴面花与地黄亲缘关系最
２ 结果与分析 近ꎬ率先聚为一支ꎬ后与美花烟草聚为一支ꎬ与相
思木(Ａｃａｃｉａ ｋｏａꎬＫＸ７８４９４２.１)、锦鸡儿( Ｃａｒａｇａｎａ
２.１ 目的基因 ＲｇＣ３Ｈ 全长 ＣＤＳ 的获取 ｓｉｎｉｃａꎬ ＨＱ８２９８５８. １ )、 木 槿 ( Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｓｙｒｉａｃｕｓꎬ
根据拼接得到的 ＣＤＳ 序列设计引物ꎬ利用 ＲＴ￣ ＪＸ００３２４９.１)的亲缘关系最远(图 ４)ꎮ
ＰＣＲ 进行扩增ꎬ结果如图 １ 所示ꎮ ＰＣＲ 产物切胶 ２.３ ＲｇＣ３Ｈ 理化性质、功能及结构域预测
回收送至上海金唯智公司进行测序所得基因序列 ２.３.１ ＲｇＣ３Ｈ 理化性质 应用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 对 ＲｇＣ３Ｈ
结果如图 ２ 所示ꎮ ＣＤＳ 全长为 １ ５３０ ｂｐꎬ编码的蛋 进 行 蛋 白 理 化 性 质 分 析ꎬ 发 现 其 分 子 式 为
白共有 ５０９ 个氨基酸残基ꎮ Ｃ ２６０８ Ｈ ４１３６ Ｎ ７０６ Ｏ ７２７ Ｓ ꎬ分子量为 ５７ ９１１. ５０ꎬ氨基酸
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总数为 ５０９ꎬ等电点(ｐＩ) 为 ８.８９ꎬ带负电荷的残基
(Ａｓｐ＋Ｇｌｕ)总数为 ６０ꎬ带正电荷的残基( Ａｒｇ＋Ｌｙｓ)
总数为 ６７ꎬ估计的半衰期为 ３０ ｈꎬ不稳定指数为
３１.１１ꎬ蛋 白 质 类 型 为 稳 定 蛋 白 质ꎮ 脂 肪 指 数 为
９０.２２ꎬ亲水性的平均值(ＧＲＡＶＹ)为－０.２０２ꎮ
２.３.２ ＲｇＣ３Ｈ 保守结构域预测 利用 ＮＣＢＩ 的 Ｃｏｎ￣
ｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ 数 据 库 分 析 结 果 表 明
ＲｇＣ３Ｈ 的保守结构域含有 Ｐ４５０ 超家族ꎬ即属于细
胞色素 Ｐ４５０ 家族成员(图 ５)ꎮ
２.３.３ ＲｇＣ３Ｈ 的 跨 膜 区 和 磷 酸 化 位 点 分 析 用
ＴＭＨＭＭ２.０ 对 ＲｇＣ３Ｈ 进行分析ꎬ结果表明 ＲｇＣ３Ｈ
没有跨膜结构ꎬ且是膜外蛋白质ꎮ 用 ＮｅｔＰｈｏｓ ３.１
Ｓｅｒｖｅｒ 对 ＲｇＣ３Ｈ 进行磷酸化结构预测得出ꎬ苏氨
酸磷酸化位点有 ２６ 个ꎻ丝氨酸磷酸化位点有 ２０
个ꎻ酪氨酸磷酸化位点有 １２ 个ꎮ
２.３.４ ＲｇＣ３Ｈ 信号肽分析 利用 Ｓｉｇｎａｌ Ｐ￣５.０ 对地
Ｍ. ＤＬ ２０００ ＤＮＡ 标记ꎻ １. ＲｇＣ３Ｈ 基因的 ＰＣＲ 产物ꎮ
Ｍ. ＤＬ ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ １. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＲｇＣ３Ｈ ｇｅｎｅ. 黄 ＲｇＣ３Ｈ 氨基酸序列进行信号肽的可能性分析ꎬ
图 １ ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增 ＲｇＣ３Ｈ 电泳 结果表明ꎬＲｇＣ３Ｈ 无信号肽ꎬ可推测该蛋白没有跨
Ｆｉｇ. １ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＲｇＣ３Ｈ 膜运输功能ꎬ不是分泌型蛋白ꎮ
２.４ ＲｇＣ３Ｈ 二级结构、三级结构预测分析
２.２ ＲｇＣ３Ｈ 同源性分析及系统进化分析 本 文 应 用 ＳＯＰＭＡ 及 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 分 别 对
通过 ＮＣＢＩ 的 Ｂｌａｓｔｎ 搜索与 ＲｇＣ３Ｈ 基因核苷 ＲｇＣ３Ｈ 的二级和三级结构进行分析ꎬ发现其中 α 螺
酸序列相似性较高的物种ꎬ用 ＤＮＡＭＡＮ６.０ 多重比 旋占最多ꎬ为 ５０.６９％ꎬ其次是无规卷曲占 ３３.９９％ꎬ
对结 果 表 明 ＲｇＣ３Ｈ 与 芝 麻 [ Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ 延伸链占 ９.４３％和 β 转角占 ５.８９％(图 ６、图 ７)ꎮ
