Page 111 - 《广西植物》2022年第12期

１２ 期 肖健等: 青枯病易感和钝感桑树品种根际土壤真菌群落结构比较 ２ １ ０ １

株对青枯病的抗性并能促进植株生长ꎻ龚云丽等 品种和钝感桑树品种各 ３ 株ꎬ以每株桑树为中心ꎬ
(２０２０)研究发现ꎬ丛植菌根真菌会抑制青枯雷尔 直径 ６０ ｃｍ 左右ꎬ挖取植株地下 １０ ~ ６０ ｃｍ 根系ꎬ
氏菌引起的姜瘟病ꎻ张深(２００７) 通过平板拮抗实 抖落根系上的大块土壤后ꎬ收集附着在根系表面
验从烟草中筛选出 １５ 个对青枯病有抑制作用的 的土壤于样品袋中ꎬ共 ６ 个土样ꎬ放入冰盒带回实
菌株ꎬ其中分泌抗菌活性物质最强的 ２ 株均为真 验室ꎬ放入－ ８０ ℃ 冰箱中保存ꎮ 干冰保存送至测
菌菌株ꎻ董夏伟(２０１１)从 ５９ 株真菌中分离出的烟 序公司提取 ＤＮＡꎬ进行高通量测序ꎮ
曲 霉 ( Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ ) 和 浅 黄 新 萨 托 菌 １.３ 土壤真菌多样性分析
(Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ ａｕｒｅｏｌａ)对烟草青枯病菌有较好抑制 土壤总 ＤＮＡ 抽提根据 Ｆａｓｔ ＤＮＡ ＳＰＩＮ Ｋｉｔ ｆｏｒ
®
作用ꎻ黎起秦等(１９９９) 筛选到 ５ 株经鉴定属于康 Ｓｏｉｌ 试剂盒(ＭＰ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓꎬＵ.Ｓ.) 操作说明进行ꎬ
氏木霉菌的真菌ꎬ它们对西瓜枯萎病、番茄青枯病 ＤＮＡ 浓度和纯度使用 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ 分光光度计

有抑制活性ꎬ并且在人工接种条件下仍有防效ꎮ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ Ｕ. Ｓ.) 进 行 检 测ꎮ 利 用
本课题组基于长期的田间调查发现ꎬ在本校 １％琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ 提取质量ꎬ并以提取
桑园教学基地中ꎬ台湾长果桑品种极易受青枯病 的土 壤 微 生 物 ＤＮＡ 为 模 板ꎬ 选 用 ＩＴＳ１Ｆ ( ５′￣
危害且普遍存在ꎻ同一块桑园ꎬ与青枯病易感桑树 ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ￣３′) 和 ＩＴＳ２Ｒ ( ５′￣
品种相邻的桂桑 １２ 号未曾发现过青枯病易感症 ＧＣＴＧＣＧＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣ￣３′)为引物对真菌 ＩＴＳ
状ꎮ 青枯病钝感品种是否通过招募有益的微生物 区进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ 常规方法回收 ＰＣＲ 产物ꎬ并进
来提高抗性和强化根际微环境生防能力ꎬ其不易 行纯化、检测定量ꎮ
感染青枯病的原因是否与其根际特有微生物的富 将同一样本的 ＰＣＲ 产物混合后使用 ２％琼脂糖
集有关等问题均有待研究ꎮ 因此ꎬ本研究以青枯 凝 胶 回 收 ＰＣＲ 产 物ꎬ 利 用 ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ Ｇｅｌ
病易感桑树品种( 台湾长果桑) 和钝感桑树品种 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ ( Ａｘｙｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙꎬ ＣＡꎬ
(桂桑 １２ 号)为对象ꎬ基于高通量测序技术ꎬ比较 ２ ＵＳＡ)进行回收产物纯化ꎬ２％ 琼脂糖凝胶电泳检
个桑树青枯病抗性不同品种植株根际土壤真菌群 测ꎬ并用 Ｑｕａｎｔｕｓ ＴＭ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ ( ＰｒｏｍｅｇａꎬＵＳＡ) 对
落结构特征ꎬ旨在探究青枯病易感桑树品种易感 回收产物进行检测定量ꎮ 基于 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ 平台
青枯病的生态机制ꎬ为筛选青枯病的拮抗微生物 (ＩｌｌｕｍｉｎａꎬＳａｎＤｉｅｇｏꎬＵＳＡ) 标准操作规程ꎬ将纯化
以及构建生态防控桑树青枯病技术体系提供理论 后的 扩 增 片 段 构 建 文 库ꎮ 利 用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 公 司 的
依据和技术支撑ꎮ Ｍｉｓｅｑ ＰＥ３００ 平台进行测序(上海美吉生物医药科
技有限公司)ꎮ
１ 材料与方法 原始测序序列使用 Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ 软件进行质
控ꎬ使用 ＦＬＡＳＨ 软件进行拼接ꎬ设置 ５０ ｂｐ 的窗
１.１ 试验地概况 口ꎬ去除质控后长度低于 ５０ ｂｐ 的序列ꎬ根据重叠
广西壮族自治区南宁市广西大学农学院教学 碱基 ｏｖｅｒｌａｐ 将两端序列进行拼接ꎬ根据序列首尾
实习基地(１０８°１７′１４″ Ｅ、２２°５１′１７″ Ｎ)ꎬ土壤类型 两端的 ｂａｒｃｏｄｅ 和引物将序列拆分至每个样本ꎬ使
为赤红壤ꎬ土壤 ｐＨ ５.７９ꎬ含有机质 ６.７５ ｇｋｇ ꎬ全 用 ＵＰＡＲＳＥ ( ｖｅｒｓｉｏｎ ７. １ ｈｔｔｐ: / / ｄｒｉｖｅ５. ｃｏｍ /
￣１
￣１ ￣１
氮 ０.８４ ｇｋｇ ꎬ全磷 ０.５３ ｇｋｇ ꎬ全钾 １４.５４ ｇ ｕｐａｒｓｅ / )软件根据 ９７％的相似度对序列进行 ＯＴＵ
￣１ ￣１
ｋｇ ꎬ碱 解 氮 ５７. ４５ ｍｇ ｋｇ ꎬ 速 效 磷 ３. ３９ ｍｇ 聚类 并 剔 除 嵌 合 体ꎬ 生 成 ＯＴＵ 表 格ꎬ 利 用 ＲＤＰ
ｋｇ ꎬ速 效 钾 ８１. ７７ ｍｇ ｋｇ ꎮ 当 地 年 平 均 气 温 ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ(ｈｔｔｐ: / / ｒｄｐ.ｃｍｅ.ｍｓｕ.ｅｄｕ / ) 对每条序列进
￣１
￣１
２１.７ ℃ ꎬ属亚热带季风气候ꎬ阳光充足ꎬ雨量充沛ꎬ 行物种分类注释ꎬ比对 Ｓｉｌｖａ 数据库ꎬ设置比对阈值
年均降雨量达 １ ６００ ｍｍꎮ 为 ７０％ꎮ 获得分类学信息和各个样本在各分类水
１.２ 样品采集 平上的群落组成ꎬ用图形进行可视化表示ꎬ使用
２０２０ 年 ６ 月ꎬ于广西大学农学院教学实验桑 Ｕｓｅａｒｃｈ 和 Ｍｏｔｈｕｒ 软 件 分 别 进 行 ＯＴＵ 丰 度 和
园随机采集青枯病易感( 台湾长果桑ꎬ６ ａꎬＳＭ) 和 Ａｌｐｈａ 多样性计算ꎬ得到样品物种信息ꎮ
钝感( 桂桑 １２ 号ꎬ６ ａꎬＩＭ) 品种植株根际土壤样 １.４ 数据统计分析
品ꎮ 采用五点取样法ꎬ随机选取青枯病易感桑树 利用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１９ 软件进行数据计算ꎬ