Page 33 - 《广西植物》2022年第12期
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１２ 期 马宇辰等: 白菜 ＣｅｓＡ 基因家族鉴定及表达模式分析 ２ ０ ２ ３
(２)该家族成员的理化性质ꎻ(３) 该家族成员的基 １.６ Ｃ 白菜 ＣｅｓＡ 基因表达分析
因结构、蛋白质二级结构及保守结构域ꎻ(４) 该家 以“蛋黄白”白菜品种为实验材料ꎮ 提取 ３０ ｄ
族成员在各组织中的表达模式以及在盐胁迫下的 苗龄的根、茎、叶和 ８０ ｄ 苗龄的花和果荚的 ＲＮＡꎬ
表达模式ꎮ 进行组织特异性表达分析ꎮ 挑选生长状况相近的
白菜幼 苗 浸 泡 于 用 Ｈｏａｇｌａｎｄ 营 养 液 配 制 的 １５０
１ 材料与方法 ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌ 溶液中ꎬ１２ ｈ 后进行材料的 ＲＮＡ
￣１
提取ꎬ并以正常水培幼苗为对照ꎬ进行盐胁迫下基
１.１ 基因家族成员鉴定及理化性质分析 因表达分析ꎮ
根据拟南芥已经鉴定的 １０ 个 ＣｅｓＡ 基因序列ꎬ 使用 ｑＰｒｉｍｅｒＤＢ￣ｑＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ(ｈｔｔｐｓ:/ /
通过 ＢＬＡＳＴ 在 白 菜 基 因 组 ( Ｂ. ｒａｐａ ｖａｒ. ｇｌａｂｒａ ｂｉｏｄｂ.ｓｗｕ.ｅｄｕ.ｃｎ/ ｑｐｒｉｍｅｒｄｂ/ ) (Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７) 设 计
ｇｅｎｏｍｅ ｖ１.５) 中搜索候选的白菜 ＣｅｓＡ 家族成员ꎬ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引物ꎬ以 ＢｒａＡｃｔｉｎ ２ 为内参基因( 表 １)ꎮ
并通过综合分析确定候选基因ꎮ 使用 ＴＢｔｏｏｌｓ 软件 使用 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 提 取 样 品 总 ＲＮＡꎬ 使 用
(Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ ) 结 合 Ｅｘｐａｓｙ ( Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ＨｉＳｃｒｉｐｔ Ⅱ ＱＲＴ ＳｕｐｅｒＭｉｘ ｆｏｒ ｑＰＣＲ 试剂盒反转录
２０１２)(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / )分析白菜 ＣｅｓＡ 基 得 到 ｃＤＮＡꎮ 使 用 ＣｈａｍＱ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ
因家族的蛋白质分子量( ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔꎬＭＷ)、 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 试 剂 盒 进 行 定 量 实 验ꎮ 反 应 体 系 ２０
等电点(ｐＩ)等理化性质ꎮ μＬ:２ μＬ ｃＤＮＡꎬ上、下游引物各 ０.４ μＬꎬ ＳＹＢＲ １０
１.２ 基因结构及保守结构域分析 μＬꎬ用灭菌 ｄｄ Ｈ Ｏ 补至 ２０ μＬꎮ ＰＣＲ 反应程序:
２
利用 ＴＢＴｏｏｌｓ 软件绘制白菜 ＣｅｓＡ 基因结构图ꎻ ９５ ℃ 预变性 ３０ ｓꎬ９５℃ 变性 １０ ｓꎬ６０ ℃ 退火 ２２ ｓꎬ
－ΔΔＣｔ
利用 ＭＥＭＥ ( Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９４) ( ｈｔｔｐ: / / ｍｅｍｅ￣ 进行 ４０ 个循环ꎮ 基因的相对表达量以 ２ 法计
ｓｕｉｔ.ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ/ ｍｅｍｅ) 在线预测 ＣｅｓＡ 蛋白质基序ꎮ 算ꎮ 所得数据通过 ＴＢｔｏｏｌｓ 进行可视化分析ꎮ
ＴＢｔｏｏｌｓ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｇｉｔｈｕｂ. ｃｏｍ / ) 绘 制 可 视 化
２ 结果与分析
ＭＥＭＥ 结构ꎬ并进行基因结构分析ꎮ
１.３ 基因在染色体上的分布及共线性关系分析
通过白菜基因组数据库对鉴定获得的 ＣｅｓＡ 基 ２.１ 白菜 ＣｅｓＡ 基因家族成员的鉴定与理化性质分析
因家族成员进行染色体分析ꎬ利用 ＴＢＴｏｏｌｓ 软件作 经筛选鉴定ꎬ得到 １６ 个白菜 ＣｅｓＡ 基因家族成
图进行分析ꎮ 使用 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ合并、建库、蛋白 员(表 ２)ꎬ分析结果表明白菜 ＣｅｓＡ 家族蛋白等电
对比ꎻ运行 ＭＣＳｃａｎＸ( Ｂｏｌｓｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)ꎬ进行下 点介于 ４.７６ ~ ９.１２ 之间ꎬ酸性蛋白与碱性蛋白的
游分析及可视化作图ꎬ从而进行共线性分析ꎬ得到 数量相近ꎬ分别为 ７ 个和 ９ 个ꎮ 分子量介于 １７.７６
共线性图ꎮ ｋＤ~ １２２.６７ ｋＤ 之间ꎮ Ｂｒａ０１１８６５ 的氨基酸数目最
１.４ 亚 细 胞 定 位 预 测 和 蛋 白 质 二 级 与 三 级 结 构 多ꎬＢｒａ００４８１４、Ｂｒａ０１０６９１ 蛋白的氨基酸数目显著
分析 少于其他成员ꎮ
使用 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ(ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ.ｃｏｍ/ ２.２ 白菜 ＣｅｓＡ 家族基因系统进化分析
ｗｏｌｆ￣ｐｓｏｒｔ.ｈｔｍｌ) 进行亚细胞 定位 ＰＲＡＢＩ( ｈｔｔｐｓ:/ / 许多物种中都有 ＣｅｓＡ 家族同源基因的进化与
ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ ＿ ａｕｔｏｍａｔ. ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ 表达(表 ３)ꎮ 为了解白菜 ＣｅｓＡ 基因家族与拟南芥
ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ. ｈｔｍｌ) 进行蛋白二级结构分析ꎮ 利用 ＣｅｓＡ 基因家族之间的进化关系ꎬ利用 ＭＥＧＡ￣Ｘ 软
Ｐｈｙｒｅ２ ( Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ ) ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｓｂｇ. 件ꎬ对两者的 ＣｅｓＡ 基因家族成员进行的系统进化
ｂｉｏ.ｉｃ.ａｃ.ｕｋ / ｐｈｙｒｅ２ / ｈｔｍｌ/ ｐａｇｅ.ｃｇｉ? ｉｄ ＝ ｉｎｄｅｘ)对白 分析(图 １)结果表明ꎬ白菜 ＣｅｓＡ 基因家族与拟南芥
菜 ＣｅｓＡ 蛋白进行三级结构预测ꎮ ＣｅｓＡ 基因家族有相近的进化关系ꎮ ＣｅｓＡ 基因可以
１.５ 白菜 ＣｅｓＡ 基因家族成员蛋白跨膜螺旋与三级 分为 ４ 个亚族ꎬ共发现有 ５ 个白菜 ＣｅｓＡ(Ｂｒａ００６４０７、
结构预测 Ｂｒａ０１２５７８、Ｂｒａ０３３７１４、Ｂｒａ０１１８６５、Ｂｒａ００６０３６)与拟南
利用 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ ｖ２. ０ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. 芥 ＣｅｓＡ 具有高度同源性ꎬ表明这 ５ 对基因具有高
ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ / ) 对白菜 ＣｅｓＡ 蛋白跨膜 度的亲缘关系ꎮ 通过对基因分化时间预测ꎬ在基
螺旋进行预测ꎮ 因进化的角度推测以 ＣｅｓＡ１ 出现时间最早ꎮ
