Page 56 - 《广西植物》2022年第12期
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２ ０ ４ ６ 广 西 植 物 ４２ 卷
设置为温度(２２±２)℃ ꎬ湿度 ６５％的环境下进行干 件ꎬ获得基因结构图ꎮ 茶树 ＴＩＦＹ 保守基序分析:
旱(２０％ ＰＥＧ￣６０００ 溶液)、盐(２０％ 氯化钠溶液) 将茶树 ＴＩＦＹ 蛋白序列提交至 ＭＥＭＥ ５.２( ｈｔｔｐ: / /
和茉莉酸甲酯(１ ｍｍｏｌＬ )胁迫ꎮ 将新鲜制备的 ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ . ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ/ ｍｅｍｅ)ꎬ基序的数目设置 为
￣１
１ ｍｍｏｌＬ 茉莉酸甲溶液喷洒在不同处理植株的 １０ꎬｍｏｔｉｆ 长度设置为 ６ ~ ５０ ａａꎬ使用 ＴＢｔｏｏｌｓ 可视化
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叶片(１ 芽 ３ 叶) 上进行激素处理ꎬ收集处理( ０、 相关数据ꎮ 使用 ＴＢｔｏｏｌｓ 可视化 ＴＩＦＹ 基因家族保
１２、２４、 ４８ ｈ) 后的 １ 芽 ３ 叶ꎻ２０％ 氯化钠溶液和 守结构域信息ꎮ
２０％ ＰＥＧ￣６０００ 溶 液 分 别 浇 灌 植 物 ( ５００ ｍＬ 溶 １.５ 茶树 ＴＩＦＹ 启动子区顺式作用元件分析
液)ꎬ收集两种处理(０、２４、４８、７２ ｈ) 后的 １ 芽 ３ 根据 １.２ 茶树基因组数据提取 ＴＩＦＹ 基因上游
叶ꎻ用光照培养箱进行 ４ ℃ 处理(０、１２、２４、４８ ｈ) ２ ０００ ｂｐ 片段作为 ＴＩＦＹ 基因的启动子序列ꎬ提交
的 １ 芽 ３ 叶ꎮ 每个处理 ３ 个株系ꎬ锡箔纸包裹标 至 Ｐｌａｎｔ Ｃｉｓ￣Ａｃｔｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ( ｈｔｔｐ: / /
记ꎬ液氮速冻后保存于－８０ ℃ 保存备用ꎮ ｂｉｏｉｎｆｏｒ￣ｍａｔｉｃｓ. ｐｓｂ. ｕｇｅｎｔ. ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｃａｒｅ /
１.２ 茶树 ＴＩＦＹ 基因的鉴定与注释 ｈｔｍｌ/ ) 分 析 启 动 序 列 的 顺 式 作 用 元 件ꎬ 使 用
从 ＴＰＩＡ 数 据 库 ( ｈｔｔｐ: / / ｔｐｉａ. ｔｅａｐｌａｎｔ. ｏｒｇ / ) 下 ＴＢｔｏｏｌｓ 可视化相关数据ꎮ
载茶树基因组以及蛋白组数据ꎮ 同时ꎬ根据已经 １.６ 茶树 ＴＩＦＹ 基因组织表达模式分析
鉴定 的 拟 南 芥 ＴＩＦＹ 序 列 提 交 给 Ｐｆａｍ 数 据 库 根据 １.２ 的数据获取方法获得茶树不同组织
(ｈｔｔｐ: / / ｐｆａｍ.ｓａｎｇｅｒ. ａｃ. ｕｋ) 获取基因家族的基本 ＴＩＦＹ 基 因 的 表 达 量 ( ＴＰＭ) 以 及 非 生 物 胁 迫 下
结构ꎬ发现 ＴＩＦＹ 结构域由 Ｐｆａｍ 登录号 ＰＦ０６２００ ＴＩＦＹ 基因在茶树中的表达量( ＴＰＭ)ꎬ使用 ＴＢｔｏｏｌｓ
表示ꎮ 使用 ＨＭＭＥＲ 以 Ｅ 值 １×ｅ 搜索茶树基因组 软件制作基因表达图谱ꎮ
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数据库 ( ｈｔｔｐ: / / ｔｐｉａ. ｔｅａｐｌａｎｔ. ｏｒｇ / ) 中 的 含 有 ＴＩＦＹ １.７ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 分析
结构域的蛋白作为 ＴＩＦＹ 家族的候选蛋白ꎬ使用 下载 茶 树 ＴＩＦＹ 基 因 家 族 序 列ꎬ 并 使 用 ＩＤＴ
ＨＭＭＥＲ 算法再次确认候选结构域是否完整ꎬ将 ( Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ) 网 站 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｇ.
ＴＩＦＹ 基因家族候选蛋白提交至 Ｐｆａｍ 数据库查询 ｉｄｔｄｎａ.ｃｏｍ / Ｓｃｉｔｏｏｌｓ/ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ/ ＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ / ) 在
具体保守结构域ꎬ删除不包含 ＴＩＦＹ 结构域的蛋白 线设 计 引 物ꎬ 选 用 ＣｓＧＡＰＤＨ 作 为 内 参 基 因 ( 表
(蓝雨纯等ꎬ２０２０)ꎮ １)ꎮ 按 照 试 剂 盒 说 明 书 提 取 茶 树 叶 片
１.３ 序列比对和系统发育分析 ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ(ＲＮＡ)(北京华越洋生物科技有限
ＴＩＦＹ 家 族 系 统 进 化 分 析: 将 拟 南 芥 公司)ꎬ然后按照试剂盒说明书( 北京君诺德生物
( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ) ＴＩＦＹ ( Ｖａｎｈｏｌｍｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ 技术有 限 公 司) 逆 转 录 成 ｃＤＮＡꎬ 用 于 实 时 定 量
２００７)、毛果杨( Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ) ( Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ＲＴ￣ｑＰＣＲꎮ 利 用 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 仪 ( Ｔ１００ Ｔｈｅｒｍａｌ
２０２０)、葡萄(Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ) ( Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２) 及 ＣｙｃｌｅｒꎬＢｉｏ￣Ｒａｄ 公司) 进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 反应ꎬ反应程
筛选到的茶树 ＴＩＦＹ 蛋白序列提交到 Ｍｕｓｃｌｅ 软件ꎬ 序参考(Ｙａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ 每个样品均设置 ３ 次
通过序列多重比对ꎬ使用 ＩＱｔｒｅｅ 软件计算氨基酸替 技术重复ꎮ 用 ２ －ΔΔＣＴ 算法计算基因相对表达水平ꎮ
换 模 型ꎬ 使 用 ＩＱｔｒｅｅ 软 件 通 过 ＭＬ ( ｍａｘｉｍｕｍ
ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ)法生成进化树ꎬ设定自举值为 １ ０００ꎻ茶 ２ 结果与分析
树 ＴＩＦＹ 种内进化分析:将茶树 ＴＩＦＹ 蛋白序列提
交到 Ｍｕｓｃｌｅ 软件ꎬ通过序列多重比对ꎬ使用 ＩＱｔｒｅｅ ２.１ 茶树 ＣｓＴＩＦＹ 基因的全基因组鉴定
软件计算氨基酸替换模型ꎬ使用 ＩＱｔｒｅｅ 软件采用 共鉴定到 １９ 个 ＴＩＦＹ 序列ꎬ命名为 ＣｓＴＩＦＹ１￣
ＭＬ 法构建种内进化树ꎬ设定自举值 １ ０００ꎮ ＣｓＴＩＦＹ１９ꎬ命 名 顺 序 参 照 Ｖｖ￣ＴＩＦＹ ( Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ
１.４ 茶树 ＴＩＦＹ 染色体定位和基因结构分析 ２０１２)ꎬ分属 ４ 个亚家族ꎬ如表 ２ 所示ꎮ
根据 １.２ 的数据获取方法提取基因组注释数 ２.２ ４ 种植物 ＴＩＦＹ 基因的系统发育分析
据中的 ＴＩＦＹ 基因在茶树染色体上的位置信息提 ８１ 个蛋白序列进行多重比对ꎬ利用 ＩＱ￣ＴＲＥＥ
交至 ＴＢｔｏｏｌｓ 软件ꎬ得到染色体定位图ꎮ 茶树 ＴＩＦＹ 构建进化树ꎬ ＴＩＦＹ 基因家族的 ４ 个亚家族成员构
基因结构分析:将茶树 ＴＩＦＹ 家族成员内含子位 成及分布如图 １ 所示ꎬ ＰＰＤ 亚蛋白家族包含茶树
置、数目信息和基因位置等信息提交至 ＴＢｔｏｏｌｓ 软 ＣｓＴＩＦＹ４ 与拟南芥 ＡｔＴＩＦＹ４ａ、ＡｔＴＩＦＹ４ｂꎬ但 ＣｓＴＩＦＹ４
