Page 45 - 《广西植物》2024年第2期
P. 45

２ 期      张世鑫等: 橡胶树形成层组织的酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库构建及 ＨｂＨＤＡ６ 互作蛋白筛选                                      ２ ４ ７

            修饰作为基因转录调控的重要方式ꎬ我们推测 ＪＡ 诱                          文库(欧阳沫等ꎬ２０１６)、巴西橡胶树地上部地下部
            导橡胶树次生乳管分化ꎬ可能是通过组蛋白乙酰化                             均一化酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库( 陈洪举等ꎬ２０１７)、
            修饰调控橡胶树次生乳管分化相关基因的转录而                              橡胶 树 未 开 割 树 和 开 割 树 胶 乳 的 酵 母 双 杂 交

            实现的ꎮ                                               ｃＤＮＡ 文库(晁金泉等ꎬ２０２１)、橡胶树膜系统酵母
                 酵母双杂交技术( ｙｅａｓｔ ｔｗｏ￣ｈｙｂｒｉｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)         双杂交 ｃＤＮＡ 文库( 聂智毅等ꎬ２０２２) 等ꎮ 由于组
            是研究 蛋 白 质 相 互 作 用 的 经 典 技 术 之 一ꎬ 是 由               蛋白乙酰化修饰调控橡胶树乳管分化的分子机制
            Ｆｉｅｌｄｓ 和 Ｓｏｎｇ 等人在研究真核生物基因转录调控                      尚未阐明ꎬ而酵母双杂交文库构建和文库筛选能
            中提出并初步建立的(Ｆｉｅｌｄｓꎬ １９９３)ꎮ 随着分子生                     够获得大量的蛋白质相互作用信息ꎬ因此使用该
            物学的发展ꎬ在酵母双杂交的基础上又建立了酵                              技术构建橡胶树次生乳管分化分子调控网络具有
            母单杂交、膜体系酵母双杂交、酵母三杂交等多项                             显著的优势ꎮ 本文使用冠菌素( ＣＯＲ) 诱导橡胶树
            技术ꎬ用于蛋白－蛋白、蛋白－ＤＮＡ / ＲＮＡ / 配体之间                     形成层分化次生乳管的实验系统ꎬ以分离形成层
            相互作用的研究ꎬ在功能基因组学和互作组学研                              组织 为 材 料ꎬ 构 建 酵 母 双 杂 交 ｃＤＮＡ 文 库ꎬ 以
            究中发挥重要作用ꎮ 利用酵母双杂交系统能够快                             ＨｂＨＤＡ６ 基因为诱饵来筛选酵母双杂交文库ꎬ筛选
            速、直接分析已知蛋白之间的相互作用ꎬ并能寻                              与 ＨｂＨＤＡ６ 相互作用的蛋白ꎮ 旨在通过酵母双杂
            找、分离与已知蛋白相互作用的配体ꎬ在研究抗原                             交技术筛选出组蛋白乙酰化修饰调控橡胶树次生
            和抗体相互作用、发现新的蛋白质和发现蛋白质                              乳管分化的基因或转录因子ꎬ为解析橡胶树次生
            的新功能、筛选药物作用位点及药物对蛋白互作                              乳管分化的分子调控网络提供理论基础ꎬ为转基
            影响、建立基因组蛋白连锁图等方面应用广泛ꎮ                              因改良橡胶树的产胶潜力提供候选基因ꎬ为高性
            与 Ｐｕｌｌ ｄｏｗｎ 技 术、凝 胶 阻 滞 技 术 ( ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ      能天然橡胶遗传改良育种提供新线索ꎮ
            ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｓｈｉｆｔ ａｓｓａｙꎬ ＥＭＳＡ)和表面等离子体共振技
            术(ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅꎬ ＳＰＲ) 等体外的蛋白           １  材料与方法
            质相互作用的研究技术相比ꎬ酵母双杂交技术能
            够更好地模拟细胞内的环境ꎬ可以更真实地反映                              １.１ 材料
            蛋白质之间 的 相 互 作 用 情 况 ( Ｐｈｉｚｉｃｋｙ ＆ Ｆｉｅｌｄｓꎬ               植物材料为巴西橡胶树无性系热研 ７￣３３￣９７
            １９９５)ꎮ 酵母双杂交系统的建立是基于对真核生                           的一年生萌条ꎬ种植在中国热带农业科学院橡胶
            物转录调控过程的认识ꎬ真核生物中基因转录需                              研究所的五队增殖苗圃内ꎬ这些萌条每年都经过
            要反式转录激活因子的参与ꎬ真核生物的转录激                              锯杆ꎬ并通过基部的潜伏芽重新生长新的萌条ꎬ并
            活因子含有两个不同的结构域ꎬ即 ＤＮＡ 结合结构                           在一 年 内 生 长 ５ ~ ６ 个 伸 长 单 位 ( ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｎｉｔꎬ
            域(ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎꎬＢＤ) 和 ＤＮＡ 转录激活结构域                 ＥＵ)(张世鑫等ꎬ２０１１)ꎮ
            (ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎꎬＡＤ)ꎬ这两个结构域能够独立分                     主要试剂和耗材:ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 多糖多酚植物
            开且功能相互不影响ꎮ ＢＤ 和 ＡＤ 分别单独起作用                         总 ＲＮＡ 提取试剂盒(ＤＰ４４１)、琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 回
            时ꎬ是不能激活转录反应的ꎬ只有当 ＢＤ 和 ＡＤ 两                         收试剂盒(ＤＰ２０４)、质粒小提试剂盒(ＤＰ１０３)、酵母
            者在空间上充分接近时ꎬ才能发挥完整的转录激                              质粒提取试剂盒(ＤＰ１１２) [购于天根生化科技(北
            活因子活性ꎬ促使下游基因的转录ꎮ 酵母双杂交                             京)有限公司]ꎻｍＲＮＡ 分离及 ｃＤＮＡ 建库使用的试
            技术的这种特点使其成为了鉴定与已知蛋白发生                              剂ꎬ 即 ＦａｓｔＴｒａｃｋ  ®   ＭＡＧ   ｍＲＮＡ    ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ
            相互作用的未知蛋白质的常用实验技术ꎬ并且在                              (Ｋ１５８００２)、 ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＴＭ  Ⅱ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ ( １１７９１￣
            解析蛋白与蛋白间的分子调控网络中起着重要作                              ０２０ )、 ＵｌｔｒａＰｕｒｅ  ＴＭ  Ｐｈｅｎｏｌ ∶ Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ∶ Ｉｓｏａｍｙｌ

            用(Ｐａｉａｎｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ                            Ａｌｃｏｈｏｌ ( ２５ ∶ ２４ ∶ １ꎬ Ｖ/ Ｖ/ Ｖ) ( １５５９３￣０３１)、５ Ｍ
                 酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库构建技术在橡胶树分                        Ａｍｍｏｎｉｕｍ Ａｃｅｔａｔｅ ( ＡＭ９０７０Ｇ)、 ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ®  ＨｉＰｕｒｅ
            子生物学研究中也有广泛的应用ꎬ如巴西橡胶树                              Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  ( Ｋ２１００￣１５ )、
            胶乳 酵 母 双 杂 交 ｃＤＮＡ 表 达 文 库 ( 杨 子 平 等ꎬ               ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＴＭ  ＤＨ１０Ｂ ＴＭ  Ｔ１ Ｐｈａｇｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｅｌｌｓ
            ２０１３)、巴西橡胶树胶乳均一化酵母双杂交 ｃＤＮＡ                         (１２０３３￣０１５)ꎬ以上均购于赛默飞世尔科技( 中国)
            文库(余海洋等ꎬ２０１６)、橡胶叶片和胶乳的 ｃＤＮＡ                        有限公司ꎻＣａｒｒｉｅｒ ＤＮＡ、培养基 ＹＰＤＡ、培养基 ＹＰＤ
   40   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50