Page 48 - 《广西植物》2024年第2期
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２ ５ ０ 广 西 植 物 ４４ 卷
在 ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋Ｘ￣α￣Ｇａｌ 缺陷型培养基平板上生长并 经 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ结果显示分化纯化的
使菌落呈现蓝色ꎬ表明同时激活了 ＨＩＳ３、ＡＤＥ２ 和 ｍＲＮＡ 呈弥散的条带且均匀分布( 图 １:Ｄ)ꎬ表明
ＭＥＬ１ ３ 个报告基因ꎮ 分离纯化得到的 ｍＲＮＡ 质量较好ꎬ可用于后续的
为了鉴定筛选到的阳性克隆的基因信息ꎬ将 实验ꎮ
上述阳性克隆的菌株ꎬ分别接种于 ＳＤ￣ＴＬ 缺陷型 ２.２ ｃＤＮＡ 初级文库和次级文库的构建和鉴定
液体培养基中ꎬ在 ３０ ℃ 、２２０ ｒｍｉｎ 条件下振荡 将 ＣＯＲ 处理橡胶树形成层区组织的 ｃＤＮＡ 初
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培养 １６ ｈꎮ 使用酵母质粒提取试剂盒[ 天根生化 级文库菌液涂板并培养后( 图 ２:Ａ)ꎬ进行 ｃＤＮＡ
科技(北京)有限公司ꎬＤＰ１１２] 提取并纯化出酵母 初级文库容量、重组率和插入片段长度的鉴定ꎮ
质粒ꎮ 将提取纯化好的酵母质粒转化到大肠杆菌 结果表明ꎬｃＤＮＡ 初级文库转化平板的容量( 平板
Ｔｏｐ１０ 感受态细胞中进行扩增ꎬ在 ３７ ℃ 、２２０ ｒ 稀释度为 １ ∶ １ ０００) ＝ ３１７ / ５０ μＬ × １ ０００ × １ ０００
ｍｉｎ 条件下振荡培养 １６ ｈꎬ使用大肠杆菌质粒小 μＬ ＝ ６.３４×１０ ＣＦＵｍＬ ꎬ高于文库构建的实验要
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提试 剂 盒 [ 天 根 生 化 科 技 ( 北 京 ) 有 限 公 司ꎬ 求 １×１０ ＣＦＵｍＬ ꎻ总克隆数为 ６.３４×１０ ＣＦＵ
ＤＰ１０３]提取大肠杆菌质粒后并送样至生工生物工 ｍＬ ×２ ｍＬ≈１.２７ × １０ ꎬ也高于文库构建标准 １ ×
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程(上海) 股份有限公司进行 ＤＮＡ 测序ꎮ 将 ＤＮＡ １０ ꎮ 并对 ｃＤＮＡ 初级文库的菌斑进行检测ꎬ随机
测序结果与 ＮＣＢＩ＿ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中的序列进行 调取 ２４ 个菌斑进行 ＰＣＲ 鉴定ꎬ发现插入效率为
ＢＬＡＳＴ 比对分析ꎬ获得与 ＨｂＨＤＡ６ 发生相互作用 １００％ꎬ插入片段长度分布于 ０.６ ~ １.２ ｋｂ 之间ꎬ平
的基因信息ꎮ 均插入片段长度为 １.１ ｋｂ(图 ２:Ｃ)ꎮ
将 ＣＯＲ 处理橡胶树形成层区组织的 ｃＤＮＡ 次
２ 结果与分析 级文库菌液涂板并培养后(图 ２:Ｂ)ꎬ进行 ｃＤＮＡ 次
级文库容量、重组率和插入片段长度的鉴定ꎮ 结
２.１ 橡胶树树皮的形成层区组织分离、总 ＲＮＡ 提 果表明ꎬｃＤＮＡ 次级文库转化平板的容量( 平板稀
取和 ｍＲＮＡ 分离纯化 释度 １ ∶ １ ０００) ＝ ３８６ / ５０ μＬ× １ ０００ × １ ０００ μＬ ＝
使用冰冻切片弦切的方法分离 ＣＯＲ 处理的一 ７.７２×１０ ＣＦＵｍＬ ꎬ高于文库构建的实验要求 １×
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年生橡胶树萌条树皮形成层区组织( 图 １:Ａ)ꎬ通 １０ ＣＦＵｍＬ ꎻ总克隆数为 ７.７２×１０ ＣＦＵｍＬ ×
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过光学显微镜观察ꎬ发现冰冻切片得到橡胶树树 ２ ｍＬ≈１.５４×１０ ꎬ也高于文库构建标准 １×１０ ꎮ 并
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皮的形成层组织没有杂质ꎬ并且绝大多数形成层 ｃＤＮＡ 次级文库的菌斑进行检测ꎬ随机挑取 ２４ 个
区细胞呈长梭形且排列致密ꎬ几乎没有其他类型 克隆进行菌落 ＰＣＲ 鉴定ꎬ发现插入效率为 １００％ꎬ
的细胞(图 １:Ｂ)ꎮ 插入片段长度分布于 １.０ ~ １.６ ｋｂ 之间ꎬ平均插入
利用 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提 片段长度为 １.２ ｋｂ(图 ２:Ｄ)ꎮ
取试剂盒( ＤＰ４４１) 提取的形成层组织的总 ＲＮＡꎬ 综上所述ꎬ本研究构建的 ＣＯＲ 处理橡胶树萌
使用 Ｔｈｅｒｍｏ ＮａｎｏＤｒｏｐ２ ０００ 微量紫外分光光度计 条树皮形成层区组织的酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库质
测定 ＲＮＡ 浓度和纯度ꎬ发现总 ＲＮＡ 的浓度较高ꎬ 量较好ꎬ可用于后续的 ＨｂＨＤＡ６ 互作蛋白的筛选
平均为 １ ６４２.９８ ｎｇμＬ ꎬＡ２６０ / Ａ２８０ 的平均值 和鉴定实验ꎮ
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为 ２.１１ꎬＡ２６０ / Ａ２３０ 的平均值为 ２.１３ꎻ经 １％琼脂 ２.３ ＨｂＨＤＡ６ 诱饵质粒构建、鉴定及自激活检测
糖凝胶电泳检测ꎬ结果显示 ２８Ｓ ｒＲＮＡ 和 １８Ｓ ｒＲＮＡ 将含有 ＨｂＨＤＡ６ 基因的载体进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ
条带清晰ꎬ两个条带的亮度比值约为 ２ ∶ １ꎬ说明提 获得了约 １.７ ｋｂ 的条带( 图 ３:Ａ)ꎬ经过与目的基
取的总 ＲＮＡ 没有降解( 图 １:Ｃ)ꎮ 本实验中提取 因的 ＤＮＡ 序列进行测序比对ꎬ显示为 ＨｂＨＤＡ６ 的
的 ＣＯＲ 不同时间段处理橡胶树形成层组织的总 编码框ꎮ 经过 Ｓｆｉ Ｉ 酶切ꎬ获得该目的基因 ＨｂＨＤＡ６
ＲＮＡ 质量较好ꎬ可用于后续的实验ꎮ 的克隆片段ꎬ并与 Ｓｆｉ Ｉ 酶切的线性化酵母双杂交
将 ８ 个时间点的 ＣＯＲ 处理形成层区组织总 诱饵载体质粒 ｐＧＢＫＴ７ 载体进行连接ꎬ获得酵母双
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ＲＮＡ 进 行 等 量 混 合 后ꎬ 利 用 磁 珠 法 ＦａｓｔＴｒａｃｋ 杂交诱饵质粒 ｐＧＢＫＴ７￣ＨｂＨＤＡ６ꎮ 经过菌落 ＰＣＲ
ＭＡＧ ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ Ｋ１５８０９６) 对 检测ꎬ发现条带大小均为 １.７ ｋｂ(图 ３:Ｂ)ꎬ并且测
总 ＲＮＡ 中的 ｍＲＮＡ 进行分离纯化ꎬ得到的 ｍＲＮＡ 序结果显示目的基因的 ＤＮＡ 序列比对正确ꎬ可进
