Page 49 - 《广西植物》2024年第2期

２ 期 张世鑫等: 橡胶树形成层组织的酵母双杂交 ｃＤＮＡ 文库构建及 ＨｂＨＤＡ６ 互作蛋白筛选 ２ ５ １

Ａ. 利用冰冻切片技术分离的形成层组织样品ꎻ Ｂ. ＣＯＲ 处
理 １ ｈ 的橡胶树树皮形成层组织的弦切面图ꎻ Ｃ. 提取的形
Ａ 和 Ｂ 分别为 ｃＤＮＡ 初级文库和次级文库的稀释液在 ＳＤ/ ￣
成层组 织 总 ＲＮＡ 的 电 泳 图ꎻ Ｄ. 利 用 磁 珠 法 分 离 纯 化
Ｌｅｕ 平板上生长情况ꎻ Ｃ 和 Ｄ 分别为 ｃＤＮＡ 初级文库和次
ｍＲＮＡ 的电泳图ꎮ
级文库插入片段的 ＰＣＲ 检测电泳图ꎻ Ｍ 为 ＤＮＡ Ｍａｋｅｒꎮ
Ａ. Ｔｈｅ ｃａｍｂｉｕｍ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｓｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅꎻ
Ａ ａｎｄ Ｂ ａｒｅ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ
Ｂ. Ｔｈｅ ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｍｂｉｕｍ ｔｉｓｓｕｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｂｙ ＣＯＲ ｆｏｒ
ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｎ ＳＤ/ ￣Ｌｅｕ ｐｌａｔｅꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｃ ａｎｄ Ｄ
１ ｈꎻ Ｃ. Ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ
ａｒｅ ｔｈｅ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ
ｃａｍｂｉｕｍ ｔｉｓｓｕｅꎻ Ｄ. Ｔｈｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ｍＲＮＡ ｉｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ｐｒｉｍａｒｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ
ｂｙ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｂｅａｄ ｍｅｔｈｏｄ.
Ｍ ｉｓ ｔｈｅ ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ.
图 １ 橡胶树萌条树皮形成层组织分离、 图 ２ ｃＤＮＡ 初级文库、次级文库的平板生长情况
总 ＲＮＡ 提取和 ｍＲＮＡ 纯化
和插入片段的 ＰＣＲ 检测图
Ｆｉｇ. １ Ｃａｍｂｉｕｍ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎꎬ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎꎬ
Ｆｉｇ. ２ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃＤＮＡ ｐｒｉｍａｒｙ ｌｉｂｒａｒｙꎬ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ａｎｄ ｍＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｂｂｅｒ ｓｈｏｒｔ ｂａｒｋｓ
ｌｉｂｒａｒｙ ａｎｄ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｄｉａｇｒａｍｓ ｏｆ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
行后续的诱饵质粒的自激活检测实验ꎮ 检测文库转化效率(图 ３:Ｄ)ꎮ 对平板的菌斑进行
通过自激活检测实验发现对照菌株在 ＳＤ￣ＴＬ 计数ꎬ结果显示 ＨｂＨＤＡ６ 基因筛选文库的转化子总
缺陷型 平 板 上 都 能 正 常 生 长ꎬ 而 仅 有 阳 性 对 照 数为 (３ ９７８ / ２０＋２ ０３８ / ２＋２８６ / ０.２) ×１ / ３×８ ０００≈

６
ｐＧＡＤＴ７￣ＬａｒｇｅＴ / ｐＧＢＫＴ７￣ｐ５３ 可在 ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋Ｘ￣α￣ ７.０６×１０ ꎬ转化效率为 ７.０６×１０ / ２５μｇ ≈２.８２×
６
￣１
Ｇａｌ 缺 陷 平 板 生 长ꎮ 然 而ꎬ 在 含 有 目 的 基 因 的 １０ μｇ ꎮ
￣１
５
ｐＧＡＤＴ７＋ｐＧＢＫＴ７￣ＨＤＡ６ 转 化 子 中 随 机 挑 选 的 ６ ＨＩＳ３、ＡＤＥ２ 和 ＭＥＬ１ 报告基因的检测结果显
个菌落在 ＳＤ￣ＴＬＨＡ＋Ｘ￣α￣Ｇａｌ 缺陷平板上均不能生 示ꎬ阳性对照在 ＳＤ￣ＴＬ＋Ｘ￣α￣Ｇａｌ 和 ＳＤ￣ＴＬＨＡ 缺陷
长ꎬ 生 长 状 态 同 阴 性 对 照 ｐＧＡＤＴ７￣ＬａｒｇｅＴ / 型培养基上都能正常生长ꎬ并使菌落呈蓝色ꎬ而阴
ｐＧＢＫＴ７￣ＬａｍｉｎＣ 一样ꎬＭＥＬ１ 检测中结果也与阴性 性对照由于不会激活 ＨＩＳ３ 和 ＡＤＥ２ 报告基因ꎬ在
对照相同ꎬ因此不存在自激活(图 ３:Ｃ)ꎮ ＳＤ￣ＴＬ 缺陷型培养基上可以正常生长但菌落不显
将 ＣＯＲ 处理橡胶树萌条树皮形成层区组织的 蓝色ꎬ而在缺少 Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ 和 Ａｄｅｎｉｎｅ 这两种成分的
酵母 双 杂 交 ｃＤＮＡ 文 库 质 粒 转 入ꎬ 用 含 有 正 确 ＳＤ￣ＴＬＨＡ 培养基平板上不能生长ꎮ 因此ꎬ本文获
ｐＧＢＫＴ７￣ＨＤＡ６ 诱饵质粒的 ＡＨ１０９ 酵母转化子作 得的 ２４ 个初始阳性克隆ꎬ能在 ＳＤ￣ＴＬＨＡ 生长并使
为受体菌来制备感受态细胞ꎬ从中取 ２０ μＬ 酵母 菌落显 蓝 色ꎬ表 明 同 时 都 激 活 了 ＨＩＳ３、 ＡＤＥ２ 和
培养物经梯度稀释后ꎬ分别涂 ３ 块 ＳＤ￣ＴＬ 平板来 ＭＥＬ１ 报告基因(图 ３:Ｅ)ꎮ