Page 46 - 《广西植物》2024年第2期
P. 46
２ ４ ８ 广 西 植 物 ４４ 卷
ｐｌｕｓ、ＳＤ/ Ｔｒｐ、ＳＤ/ Ｌｅｕ、ＳＤ/ Ｈｉｓ/ Ｌｅｕ / Ｔｒｐ (ＴＤＯ)、ＳＤ/ ＤＨ１０Ｂ 感受态细胞中ꎮ 将电转化后的菌液ꎬ在摇
￣１
Ａｄｅ / Ｈｉｓ/ Ｌｅｕ / Ｔｒｐ ( ＱＤＯ)、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ Ａ、 Ｘ￣α￣Ｇａｌ 床里 ３７ ℃ 、２２０ ｒｍｉｎ 活化培养 １ ｈꎮ 培养结束
均 购 自 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 公 司ꎻ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 后ꎬ取一部分菌液涂布平板进行初级文库容量、重
(ＡＰ２２１￣０１)购于北京全式金生物技术股份有限公 组率和插入片段长度的鉴定ꎮ 剩余的菌液加入甘
司ꎻ冠菌素( ｃｏｒｏｎａｔｉｎｅꎬ ＣＯＲ)、ＤＭＳＯ、乙酰丁香酮 油ꎬ至终浓度 ２０％ꎬ于－８０ ℃ 保存ꎬ即得到 ＣＯＲ 诱
(ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ)、ＭＥＳ、ＭｇＣｌ 、ＰＥＧ、ＴＥ、ＬｉＡｃ 等试剂 导橡胶树形成层组织的 ｃＤＮＡ 初级文库菌液ꎮ
２
均购于 Ｓｉｇｍａ 公司ꎻ其他试剂均为国产分析纯ꎬ枪头 将上一步骤中验证合格的 ｃＤＮＡ 初级文库ꎬ使
®
和离心管均为 Ａｘｙｇｅｎ 公司产品ꎮ 用 ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｆｉｌｔｅｒ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ
１.２ 冠菌素(ＣＯＲ)处理植物材料 (Ｌｉｆｅꎬ Ｋ２１００￣１５) 提取文库质粒ꎮ 将得到的初级
选 取 一 年 生 橡 胶 树 萌 条 的 第 三 伸 长 单 位 文库质粒ꎬ稀释到 ３００ ｎｇμＬ ꎬ使用 ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＴＭ
￣１
(ＥＵ３)ꎬ节间长且健壮的 树 干 作 为 实 验 材 料ꎬ在 Ⅱ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 进行文库质粒重组ꎬ并提取重组产
ＥＵ３ 树干中部ꎬ使用单面刀片刮去面积为 ２ ｃｍ × 物后使用 ＢＴＸ 指数衰减波电穿孔仪 ＥＣＭ６３０ 将重
４ ｃｍ的茎表皮及部分皮层ꎬ用面积略大的灭菌无 组产物转化到大肠杆菌 ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ＤＨ１０Ｂ 感受
￣１ 态细胞中ꎬ然后进行培养ꎬ条件同上ꎮ 取转化后的
尘纸包裹处理部位ꎬ施加含有 ６ μｇｍＬ 的 ＣＯＲ
溶液ꎬ用塑料封口膜缠绕并密封包裹ꎮ 处理时间 １０ μＬ 菌液稀释 １ ０００ 倍ꎬ再取 ５０ μＬ 稀释后的菌
分别为 ０.５ ｈ、１ ｈ、２ ｈ、４ ｈ、８ ｈ、１ ｄ、２ ｄ 和 ３ ｄꎮ 然 液ꎬ涂布 ＬＢ 平板( 含链霉素抗性)ꎬ３７ ℃ 培养过
后拆去塑料封口膜和无尘纸ꎬ切取处理部位的树 夜ꎮ 进行次级文库容量、重组率和插入片段长度
皮( 带部分木质部)ꎬ并立即分割成小块ꎬ置于 ２ 的鉴定ꎮ 剩余的菌液加入甘油ꎬ至终浓度 ２０％ꎬ于
ｍＬ 离心管中ꎬ液氮速冻ꎮ 每个时间点的形成层区 －８０ ℃ 保存ꎬ即得到 ＣＯＲ 诱导橡胶树形成层组织
样品取自 ５ 株橡胶树萌条进行混合ꎬ并且每个时 的 ｃＤＮＡ 次 级 文 库 菌 液ꎮ 文 库 的 细 菌 菌 落 总 数
间点进行 ３ 组生物学重复ꎬ即每个时间点的共计 (ＣＦＵ)计算方法如下:
￣１
处理 １５ 株橡胶树萌条ꎮ ＣＦＵ 浓度(ＣＦＵｍＬ )＝ 平板上的克隆数 / ５０
１.３ 总 ＲＮＡ 提取及 ｍＲＮＡ 的纯化 μＬ× １ ０００ 倍×１ ０００ μＬꎻ
使用冰冻切片弦切的方法收集橡胶树树皮的 文库总 ＣＦＵ＝ＣＦＵ 浓度×文库菌液总体积(ｍＬ)ꎮ
形成层区组织ꎬ使用 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ 多糖多酚植物 １.５ ＨｂＨＤＡ６ 诱饵质粒构建、鉴定及自激活检测
总 ＲＮＡ 提取试剂盒( 天根ꎬＤＰ４４１) 提取总 ＲＮＡꎮ ＨｂＨＤＡ６ 诱饵质粒构建时ꎬ先对含有目的基因
通过微量紫外分光光度计测定 ＲＮＡ 浓度和纯度ꎬ ＨｂＨＤＡ６ 的载体进行 ＰＣＲ 扩增后ꎬ进行 Ｓｆｉ Ｉ 酶切ꎬ
使用 １％琼脂糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ 完整性后ꎬ合 获得目的基因 ＨｂＨＤＡ６ 的克隆片段ꎮ 使用 Ｓｆｉ Ｉ 酶
格的总 ＲＮＡ 样品于－８０ ℃ 冰箱中保存备用ꎮ 将得 切ꎬ 获 得 线 性 化 的 酵 母 双 杂 交 诱 饵 载 体
到的不 同 时 间 段 ＣＯＲ 处 理 的 形 成 层 区 组 织 总 (ｐＧＢＫＴ７)ꎬ再将目的基因 ＨｂＨＤＡ６ 的克隆片段连
®
ＲＮＡ 进行等量混合ꎬ利用磁珠法 ＦａｓｔＴｒａｃｋ ＭＡＧ 接到线性化的诱饵载体(ｐＧＢＫＴ７)上ꎮ
ｍＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ Ｋ１５８０９６ ) 对 总 具体操作如下:根据 ＨｂＨＤＡ６ 基因的 ｃＤＮＡ 序
ＲＮＡ 中的 ｍＲＮＡ 进行分离纯化ꎬ将 ｍＲＮＡ 进行等 列ꎬ设计引物时分别在其两端添加 Ｓｆｉ Ｉ 的酶切位
量混合后ꎬ用于后续的酵母双杂交文库构建ꎮ 点序列ꎬ用于扩增 ＨｂＨＤＡ６ 基因的 ｃＤＮＡ 片段ꎮ 引
１.４ 酵母双杂交文库的构建 物序列为 ＨｂＨＤＡ６￣Ｆ(５′￣ａａｇｇｃｃａｔｔａｃｇｇｃｃＡＴＧＧＧＣＧ
ＴＭ
用 Ｇａｔｅｗａｙ 重 组 技 术ꎬ 使 用 ＣｌｏｎｅＭｉｎｅｒ Ⅱ ＡＣＡＣＡＡＣＣＧＧＴＧＧＴ￣３′)和 ＨｂＨＤＡ６￣Ｒ(５′￣ｃｃｇｇｃｃｇａ
ｃＤＮＡ 文库构建试剂盒能够快速构建 ｃＤＮＡ 文库ꎮ ｇｇｃｇｇｃｃＴＣＡＡＧＡＡＣＧＣＧＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＴ￣３′)ꎮ
操作流程:将分离纯化并等量混合后的 ｍＲＮＡ 为 并按照 ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ( ＡＰ２２１￣０１) 高保
模板 进 行 反 转 录ꎬ 先 合 成 ｃＤＮＡ 第 一 链 后 合 成 真酶体系进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ使用 Ｓｆｉ Ｉ 进行 ＨｂＨＤＡ６
ｃＤＮＡ 双链ꎬ再将得到的双链 ｃＤＮＡ 进行分级分离 扩增片段的酶切和 ｐＧＢＫＴ７ 载体的线性化ꎮ 使用
ＴＭ Ａｘｙｇｅｎ 胶回收试剂盒进行酶切产物回收ꎮ 将回收
并收集ꎮ 使用 ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ Ⅱ Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ 进行 ＢＰ
重 组 反 应ꎻ 使 用 ＢＴＸ 指 数 衰 减 波 电 穿 孔 仪 的酶切产物ꎬ连 接 转 化 到 大 肠 杆 菌 Ｔｏｐ１０ 中ꎬ在
ＥＣＭ６３０ 进 行 电 转 化 到 大 肠 杆 菌 ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ ３７ ℃ 条件下恒温培养过夜ꎮ 从上述连接体系转化
