Page 131 - 《广西植物》2026年第7期

７ 期 刘城等: ＺｎＯ￣ＮＰｓ＋ＳｉＯ ￣ＮＰｓ 提高洋桔梗幼苗抗温度胁迫能力的研究 １ ２ ２ ７
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温度胁迫:预处理洋桔梗幼苗(根据第一阶段 ｊｐ)基因序列ꎬ用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 设计基因特异
筛选的组合方案→将幼苗置于人工气候箱中培养 性引物并合成引物(昆明擎科生物技术有限公司)
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１５ ｄ(２５ ℃ꎬ１４ ｈ 光照/ １０ ｈ 黑暗ꎬ光通量密度为 ４００ (表 ２)ꎮ 反 应 体 系: Ｈｉｅｆｆ ｑＰＣＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ
￣２ ￣１
μｍｏｌｍ ｓ ꎬ相对湿度为 ５５％)→温度胁迫 ２４ ｈ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (Ｎｏ Ｒｏｘ) 试剂 １０ μＬꎬ正反引物各 ０.４
(对照组温度 ２５ ℃ꎬ高温 ４２ ℃ꎬ低温 ４ ℃)ꎮ 温度 μＬꎬ模板 ＤＮＡ ２ μＬꎬ无菌超纯水 ７.２ μＬꎮ 扩增程
胁迫结束后立即取材ꎬ于－１９６ ℃液氮中保存ꎮ 序:９５ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎬ９５ ℃ 变性 １０ ｓꎬ６０ ℃ 退火
１.３ 试验方法 ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 每个样品 ３ 个重复ꎬ使用 ２ －△△Ｃｔ
１.３.１ 株 高 和 相 对 含 水 量 的 测 定 参 照 刘 鹏 等 计算相对表达量ꎮ
(２０２４)的方法ꎬ使用精确到 １ ｍｍ 的直尺测定株 １.４ 数据分析

高ꎮ 参照 Ｚｈａｏ 等(２０２４)的方法测定相对含水量ꎮ 所有试验重复 ３ 次ꎬ用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１９ 整
１.３.２ 叶绿素含量的测定 参照李合生(２０００) 的 合数据ꎬ采用 ＳＰＳＳ ２７.０ 软件( ＳＰＳＳ ＩｎｃꎬＣｈｉｃａｇｏꎬ

方法测定总叶绿素含量ꎮ ＩＬꎬＵＳＡ)进行方差和差异性分析ꎬ利用 Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ
１.３.３ 过氧化氢( ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅꎬＨ Ｏ )、丙二醛 １４.０ 作图ꎮ
２ ２
(ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅꎬＭＤＡ)的含量和相对电导率测定
(１)Ｈ Ｏ 含量:用 Ｈ Ｏ 测试盒( Ａ０６４￣１￣１ꎬ南 ２ 结果与分析
２ ２ ２ ２
京建成生物工程研究所) 测定叶片中 Ｈ Ｏ 含量ꎬ
２ ２
具体操作步骤和计算方法按照试剂盒说明书ꎮ ２.１ 正交试验筛选 ＺｎＯ￣ＮＰｓ＋ＳｉＯ ￣ＮＰｓ 最佳处理
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(２) ＭＤＡ 含 量 的 测 定: 使 用 ＭＤＡ 试 剂 盒 方案
(Ａ００３￣１ꎬ南京建成生物工程研究所)ꎬ具体操作步 用正交试验设计了 ９ 组处理(表 １)ꎬ对洋桔梗
骤和计算方法按照试剂盒说明书ꎮ 幼苗 叶 面 喷 施 后ꎬ 如 图 １ 所 示ꎬ 组 合 ２ ( 浓 度
(３)相对电导率的测定:用打孔器切取洋桔梗 ０.０３％ꎬ喷施 ２ 次ꎬ配比 １ ∶ ２) 幼苗生长旺盛ꎬ叶片
幼苗叶片圆片ꎬ按照李合生(２０００) 的方法测定电 舒展、叶色浓绿、株高增加ꎮ 地上部与地下部相对
导率 ꎮ 含水量(分别为 ８４.２７％和 ９０.７６％) 及叶绿素含量
１.３.４ 抗氧化酶活性的测定 ＳＯＤ 活性测定使用 (０.８５ ｍｇｇ )显著高于其他处理组(表 ３)ꎮ 极差
￣１
ＳＯＤ 试剂 盒 ( Ａ００１￣１￣１ꎬ 南 京 建 成 生 物 工 程 研 究 Ｒ 分析表明ꎬ各因素影响程度为浓度( Ａ) >配比
所)ꎬＣＡＴ 活性测定使用 ＣＡＴ 试剂盒(Ａ００７￣１￣１ꎬ南 (Ｃ) >次数( Ｂ)ꎮ 因此ꎬ后续温度胁迫实验采用组
京建成生物工程研究所)ꎬＰＯＤ 活性测定使用 ＰＯＤ 合 ２ 方案预处理洋桔梗幼苗ꎮ
试剂盒(Ａ０８４￣３￣１ꎬ南京建成生物工程研究所)ꎬ具体 ２.２ ＺｎＯ￣ＮＰｓ＋ＳｉＯ ￣ＮＰｓ 预处理对温度胁迫下洋
２
操作步骤和计算方法按照各试剂盒说明书ꎮ 桔梗幼苗形态的影响
１.３.５ 实时荧光定量 ＰＣＲ(ｑＰＣＲ) 由图 ２ 可知ꎬ当洋桔梗幼苗在 ２４ ｈ 的 ４２ ℃ 胁
１.３.５.１ ＲＮＡ 提取、反转录及 ｃＤＮＡ 的扩增 利用 迫后ꎬ对照组幼苗的叶色变暗淡ꎬＺｎＯ￣ＮＰｓ ＋ ＳｉＯ ￣
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Ｔｒｉｚｏｌ 法提取 ＲＮＡ( 尹慧等ꎬ２００８)ꎬ用 Ｒｅｖｅｒｔ Ａｉｄ ＮＰｓ 预处理的幼苗叶片颜色保持鲜亮ꎻ当幼苗受 ４
Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 试剂盒( 赛默飞世 ℃ 胁迫后ꎬ对照组的幼苗不仅叶片暗淡且明显萎
尔技术公司) 将总 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡꎮ 扩增反 缩ꎬ试验组胁迫前后在形态上无明显变化ꎮ

转录的第一链 ｃＤＮＡꎮ 反应体系如下:ＲＮＡ ５ μＬ、 ２.３ ＺｎＯ￣ＮＰｓ＋ＳｉＯ ￣ＮＰｓ 预处理对温度胁迫下洋
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Ｏｌｉｇｏｄ (ｄＴ) Ｐｒｉｍｅｒ １ μＬ、Ｗａｔｅｒ ６ μＬꎮ 扩增程序: 桔梗幼苗叶片的叶绿素含量、相对电导率、ＭＤＡ
９８ ℃ 变性 １０ ｓꎬ５５.６ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ 含量和 Ｈ Ｏ 含量的影响
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３０ 个循环ꎮ 将 产 物 ｃＤＮＡ 溶 液 贮 藏 于 － ２０ ℃ 冰 如图 ３:Ａ 所示ꎬ温度胁迫后ꎬ对照组与 ＺｎＯ￣ＮＰｓ＋
箱ꎬ用于后续的 ｑＰＣＲ 实验ꎮ ＳｉＯ ￣ＮＰｓ 预 处 理 的 叶 绿 素 均 降 低ꎬ 而 ＺｎＯ￣ＮＰｓ ＋
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１.３.５.２ ｑＰＣＲ 检测抗氧化酶相关基因 ＨＳＰ９０ 和 ＳｉＯ ￣ＮＰｓ 预处理的含量高于对照组ꎮ 如图 ３:Ｂ 所
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ＣＯＲ４１３ 的相对表达量 根据洋桔梗 Ｃｕ / Ｚｎ￣ＳＯＤ、 示ꎬ４２ ℃ 和 ４ ℃ 胁迫均导致洋桔梗叶片的相对电
Ｆｅ￣ＳＯＤ、 Ｍｎ￣ＳＯＤ、 ＰＯＤ、 ＣＡＴ、 ＨＳＰ９０ 及 ＣＯＲ４１３ 导率上升ꎻ与对照组相比ꎬＺｎＯ￣ＮＰｓ＋ＳｉＯ ￣ＮＰｓ 预处
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(序 列 来 源: Ｐｌａｎｔ ＧＡＲＤＥＮꎬ ｈｔｔｐｓ: / / ｐｌａｎｔｇａｒｄｅｎ. 理能极显著降低洋桔梗幼苗在 ４ ℃ 胁迫后的叶片