Page 94 - 《广西植物》2024年第10期

１ ８ ９ ６ 广 西 植 物 ４４ 卷
叶片与健叶之间的微生物群和化学因子差异ꎬ但 １.３ 数据质控及群落结构与多样性分析
未对不同病害程度的野火病烟叶做出进一步分 下 机 数 据 经 Ｃｕｔａｄａｐｔ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｃｕｔａｄａｐｔ.
析ꎮ 烟草野火病不但在田间为害烟叶ꎬ而且在烟 ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ.ｉｏ / ｅｎ / ｖ１.９.１ / )软件剔除、过滤低质量序
叶采收后至烘干前仍可继续为害ꎬ导致叶片病斑 列ꎬ以及 ＵＣＨＩＭＥ 算法去除嵌合体序列ꎬ最终得到
继续扩大变成枯焦状而失去烘烤价值ꎮ 因此ꎬ亟 有效 序 列 ( ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ)ꎮ 使 用 ＵＰＡＲＳＥ ( ｈｔｔｐ:/ /
须阐明其病害流行程度与叶际微生物群落的动态 ｗｗｗ.ｄｒｉｖｅ５.ｃｏｍ/ ｕｓｅａｒｃｈ / )软件在相似度≥９７％的条
变化ꎮ 鉴于此ꎬ本研究以不同发病程度的烟草野 件下对 ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 进行 ＯＴＵ( ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ
火病烟叶为研究对象ꎬ采用高通量测序技术ꎬ拟探 ｕｎｉｔｓ) 聚类ꎬ筛选每个 ＯＴＵ 的代表性序列ꎬ并基于
讨以下问题:(１)不同程度发病烟叶病斑组织与健 Ｍｏｔｈｕｒ 算法将 ＯＴＵ 代表性序列与 Ｕｎｉｔｅ(７.２) 数据
康组织中微生物群落结构与多样性差异ꎻ(２) 不同 库和 Ｓｉｌｖａ１３２ 数据库比对、注释物种分类(Ｅｄｇａｒ ＆
发病程度病斑组织微生物群落的变化ꎻ(３) 不同发 Ｒｏｂｅｒｔꎬ ２０１３ꎻ Ｕｒｍａｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ 利用 Ｒ 语言工
病程度烟叶组织微生物的功能变化ꎮ 旨在为认识 具绘 制 物 种 群 落 柱 状 图、 主 成 分 分 析 ( ｐｒｉｎｃｉｐａｌ
烟草野火病的演变规律提供科学依据ꎮ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ＰＣＡ) 图和 Ｖｅｎｎ 分析图等ꎮ 利
用 ＱＩＩＭＥ(ｈｔｔｐｓ:/ / ｄｏｃｓ.ｑｉｉｍｅ２.ｏｒｇ)按样本最小序列
１ 材料与方法 数进行样本序列抽平后ꎬ计算样品微生物群落 α 多
样性指数( Ｓｈａｎｎｏｎ、Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｃｈａｏ１ 等)ꎻ使用 ＤＰＳ
１.１ 样品采集 软件(ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｄｐｓｗ.ｃｎ / ｄｏｗｎｌｏａｄ.ｈｔｍｌ)进行不同
２０１９ 年 ６ 月ꎬ在种植品种为云烟 ８７ 的贵州省 组别物种相对丰度的差异性分析ꎮ 采用 Ｔａｘ４Ｆｕｎ 程
施秉 县 烟 叶 产 区 ( １０７° ５１′ ３６″—１０８° ２８′ ５１″ Ｅ、 序语言及 ＦＵＮＧｕｉｌｄ 和 ＫＥＧＧ 数据库分析真菌、细菌
２６°４９′４７″—２７°２１′１５″ Ｎ)采集移栽 ６０ ｄ 后发生烟 群落的功能类群(孙美丽等ꎬ２０２３)ꎮ
草野火病的烟叶样品ꎬ根据病斑面积占比分为轻
２ 结果与分析
度(５％ ~ １０％)、中度(１１％ ~ ２０％) 和重度(２１％ ~
５０％)叶片(图 １)ꎬ依次记为 Ａ、Ｂ、Ｃꎮ 用无菌剪刀
剪取样品叶片的病斑组织( ｂ) 和健康组织( ｊ)ꎬ分 ２.１ 测序深度评估及数据质控
别混合均匀置于 ５０ ｍＬ 无菌离心管中ꎬ每个样品 ３ 稀释性曲线结果显示ꎬ叶际细菌的 ＯＴＵ 数在
管ꎬ每管 ５ ｇꎮ 样品采集后放入低温保存箱ꎬ并迅 测序数据量为 ２ ３００ 时曲线趋于平坦(图 ２:Ａ)ꎬ叶
速带回实验室ꎬ置于－８０ ℃ 冰箱保存、备用ꎮ 际真菌的 ＯＴＵ 数在测序数据量为 ４０ ０００ 时曲线
１.２ 基因组 ＤＮＡ 提取、ＰＣＲ 扩增及高通量测序 趋于平坦( 图 ２:Ｂ)ꎬ表明测序数据已包含所测样
®
参 照 Ｆａｓｔ ＤＮＡ ＳＰＩＮ 试 剂 盒 ( ＭＰ 品中绝大多数的物种信息ꎬ测序结果合理ꎮ
Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ)使用说明ꎬ提取叶际微生物基因组总 原始测序数据质控后ꎬ平均每组样品的细菌和
ＤＮＡꎬ 经 超 微 量 分 光 光 度 计 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ 真菌分别获得 ８０ ０９２ 条和 ７０ １４７ 条高质量序列(表
(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)检测质量与浓度后ꎬ用无 １)ꎮ 细菌与真菌原始测序数据的 ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ

￣１
菌水将 ＤＮＡ 稀释至 １ ｎｇμＬ 备用ꎮ Ｎｕｍｂｅｒ 分别为 ＰＲＪＮＡ１０２５８３２、ＰＲＪＮＡ１０２５３７０ꎮ
细菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因和真菌转录间隔区 ＩＴＳ１ ２.２ 叶际细菌与真菌群落结构
区分别采用引物 ５１５Ｆ / ８０６Ｒ(Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)和 ２.２.１ 门水平叶际群落结构 健康与病斑组织的
ＩＴＳ５￣１７３７Ｆ / ＩＴＳ２￣２０４３Ｒ(Ｗｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９) 进行扩 细菌群落包括变形菌门( Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ)、厚壁菌门

增ꎮ ＰＣＲ 扩增体系及程序参照 Ａｐｐｒｉｌｌ 等(２００５)ꎮ (Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ)和拟杆菌门( Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ)ꎬ其中病斑
扩增 产 物 经 ２％ 浓 度 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测、 组织变形 菌 门 的 相 对 丰 度 高 于 健 康 组 织 ( 图 ３:
ＧｅｎｅＪＥＴ 胶 回 收 产 物 纯 化 试 剂 盒 ( Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ａ)ꎮ 轻度、中度和重度病叶病斑组织的优势细菌
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)纯化后送至北京诺禾致源科技股份有限 门为变形菌门( 相对丰度分别为 ４９.４４％、７２.３９％
公 司ꎬ 利 用 Ｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｉｂｒａｒｙ 试 剂 盒 和 ６１.９２％)ꎬ其次为厚壁菌门( 相对丰度分别为
(Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ) 构 建 文 库 并 在 Ｉｏｎ ０.０１％、１.５４％和 ０.７３％)和拟杆菌门( 相对丰度分
Ｓ５ＴＭＸＬ 平台上进行测序ꎮ 别为 ０.０６％、０.１９％和 ０.０６％) ꎮ 健康组织优势细