Page 124 - 《广西植物》2024年第12期

２ ２ ８ ２ 广 西 植 物 ４４ 卷
ｍｇ)ꎬ经半制备高效液相色谱( Ｃ 柱ꎬ甲醇 ∶ 水 ＝ 待测 样 品 的 吸 光 度 值ꎻ ＯＤ 表 示 空 白 的 吸 光
１８ 空白
４０ ∶ ６０ 恒梯度洗脱ꎻ流速 ４ ｍＬｍｉｎ ꎻ检测波长 度值ꎮ
￣１
＋
１.８ ＴＥＡＣ 法测定 ＡＢＴＳ 清除活性
２３０ ｎｍ)ꎬ分 离 得 到 化 合 物 ２ ( ３. ２ ｍｇꎬ ｔ ＝ １５. ４
Ｒ
称取 １９.５４ ｍｇ 的 ＡＢＴＳ 溶于 ５ ｍＬ 双蒸水
＋
ｍｉｎ)和化合物 １ (４.５ ｍｇꎬｔ ＝ １７.２ ｍｉｎ)ꎻＦｒ.１６.４
Ｒ
(２１０.４ ｍｇ) 依次经 Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ ( 甲醇)、半制 中ꎬ３.３２ ｍｇ 的 Ｋ Ｓ Ｏ 溶于 ８８ μＬ 双蒸水中ꎬ将两
２
８
２
备高效液相色谱( Ｃ 柱ꎬ甲醇 ∶ 水 ＝ ２３ ∶ ７７ 恒梯 种溶液充分混匀后 ３０ ℃ 避光处理 １２ ｈ 后ꎬ加入约
１８
度洗脱ꎻ流速 ４ ｍＬｍｉｎ ꎻ检测波长 ２１０ ｎｍ)ꎬ分 ２００ ｍＬ 蒸馏水稀释ꎬ通过酶标仪检测在 ７３４ ｎｍ 波
￣１
离得到化合物 ３ (１.７ ｍｇꎬｔ ＝ ２７.０ ｍｉｎ)、化合物 ４ 长处的 吸 光 度ꎬ直 至 稀 释 到 其 ＯＤ 值 为 ( ０. ７０ ±
Ｒ
＋
０.０２)ꎬ 配 制 成 ＡＢＴＳ 溶 液ꎮ 配 制 ｔｒｏｌｏｘ ( ２００
(２.２ ｍｇꎬｔ ＝ ３１.２ ｍｉｎ) 和化合物 ５ (３.０ ｍｇꎬｔ ＝
Ｒ Ｒ
μｇｍＬ )ＤＭＳＯ 溶液作为阳性对照ꎬ称取样品用
￣１
４９.１ ｍｉｎ)ꎮ
１.６ 抗炎活性测试 ＤＭＳＯ 溶 液 溶 解 并 配 制 成 样 品 溶 液 ( ２００ μｇ
ｍＬ )作为待测样品组ꎬ将对照组和待测组均稀释
￣１
抗炎活性测试参考胡梦君(２０１７) 的实验方法
７ 个梯度ꎮ
进行测试ꎮ
选取 ＲＡＷ ２６４. ７ 细 胞ꎬ 空 白 组 为 含 脂 多 糖 将稀释的 ７ 个浓度的待测液体分别取 １６０ μＬ
于 １.５ ｍＬ 离心管中ꎬ再加入 ４８０ μＬ ＡＢＴＳ 溶
＋
(ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅꎬＬＰＳ) 的培养基ꎬ对照组为槲皮
液ꎬ摇匀后避光放置 ６ ｍｉｎꎬ取 ２００ μＬ 加入 ９６ 孔板
素ꎬ阴性对照组为 ＤＭＳＯꎬ实验组加入单体化合物ꎮ
中ꎬ重复 ３ 次ꎻ若样品颜色较深则需要减去样品本
用酶标仪在 ５４０ ｎｍ 波长下每组平行测定 ３ 次ꎬ计
底吸收ꎬ本底组为 １６０ μＬ ＤＭＳＯ 溶液ꎬ加入乙醇溶
算 ＮＯ 的抑制率ꎮ 将初筛活性良好的化合物倍半
液 ３２０ μＬꎬ取 ２００ μＬ 于 ９６ 孔板中ꎬ重复 ３ 次ꎮ 利
稀释 ５ 个梯度ꎬ分别计算其抑制率ꎬ并计算其 ＩＣ ꎮ
用酶标仪检测在 ７３４ ｎｍ 波长下每个孔的 ＯＤ 值
５０
抑制率的公式如下:
(Ｐａｙｅｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５)ꎮ
抑制率(％)＝ (Ａ －Ａ ) / (Ａ －Ａ ) ×１００ꎻ
２ １ ２ ０
式中:Ａ 表示空白对照组( 不加 ＬＰＳ) 吸光度 计算化合物抗氧化能力的公式同 １.７ꎮ
０
值ꎻＡ 表示实验组的吸光度值ꎻＡ 表示阴性对照组
１ ２ ２ 结果与分析
(加 ＬＰＳ)的吸光度值ꎮ
１.７ ＤＰＰＨ 法抗氧化能力测试
２.１ 石油醚相 ＧＣ￣ＭＳ 分析结果
准确配制 ０.１ ｍｏｌｍＬ ＤＰＰＨ 储备液ꎬ冷藏
￣１
按上述 ＧＣ￣ＭＳ 条件对石油醚萃取相的化学成
储存ꎮ 配制维生素 Ｃ(２００ μｇｍＬ ) ＤＭＳＯ 溶液
￣１
分进行分析ꎬ得到总离子流色谱图( 图 １)ꎮ 运用
作为阳性对照ꎬ称取样品用 ＤＭＳＯ 溶液溶解并配
峰面积归一法计算化合物的相对百分含量ꎬ所鉴
￣１
制成样品溶液(２００ μｇｍＬ ) 作为待测样品组ꎬ
定出的化学成分及其含量分析结果见表 １ꎬ共鉴定
将对照组和待测组均稀释 ７ 个梯度ꎮ
出 １７ 个化学成分ꎬ占总相对含量的 ８１.３５％ꎮ 结果
将稀释 ７ 个浓度的待测溶液分别取 ３２０ μＬ 于 显示ꎬ相 对 含 量 较 高 的 化 学 成 分 为 棕 榈 酸 甲 酯
１.５ ｍＬ 离心管中ꎬ再加入 ３２０ μＬ ＤＰＰＨ 储备液ꎬ摇 (１３. ５０％)、 亚 油 酸 甲 酯 ( １２. ７３％)、 亚 麻 酸 甲 酯
匀后避光放置 ３０ ｍｉｎꎬ取 ２００ μＬ 加入 ９６ 孔板中ꎬ (８.７４％)、２￣单棕榈酸甘油(５.２８％)ꎬ共占相对含
重复 ３ 次ꎻ若样品颜色较深则需要减去样品本底 量的 ４０.２５％ꎮ 其中ꎬ２ꎬ２′￣亚甲基双￣(４￣甲基￣６￣叔
吸收ꎬ本底组为 ３２０ μＬ ＤＭＳＯ 溶液ꎬ加入乙醇溶液 丁基苯酚)为塑化剂(程畅等ꎬ ２０２１)ꎬ可能由于在
３２０ μＬꎬ取 ２００ μＬ 于 ９６ 孔板中ꎬ重复 ３ 次ꎮ 利用 样品初期提取时用塑料桶浸泡所致ꎮ ＧＣ￣ＭＳ 结果
酶标仪检测在 ５１７ ｎｍ 波长下每个孔的 ＯＤ 值( Ｈｕ
显示石油醚相的主要成分均为脂肪酸类化合物ꎮ
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ ２.２ 结构鉴定
计算化合物抗氧化能力的公式如下: 利用硅胶、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ￣２０ 柱色谱和半制备高
ＯＤ 样品 － ＯＤ 本底 效液相色谱等各种色谱技术对乙酸乙酯萃取相进
清除率(％) ＝ (１－ ) × １００ꎻ
ＯＤ 空白 行分离纯化得到 １５ 个化合物ꎬ经质谱和核磁共振
式中:ＯＤ 本底 表示本底的吸光度值ꎻＯＤ 样品 表示 波谱分析ꎬ化合物结构鉴定如图 ２ 所示ꎮ