Page 41 - 《广西植物》2024年第12期
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１２ 期 李小琴等: 单氰胺破除葡萄休眠生理生化响应及相关基因克隆与表达分析 ２ １ ９ ９
中发挥重要作用( 陈仲等ꎬ２０１１)ꎮ 另外ꎬＦＴ 基因 休眠的分子和生理生化机制ꎬ为解析单氰胺打破葡
在储藏器官发育( Ｎａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)、腋芽形成 萄休眠的机理并进一步指导单氰胺的应用奠定理
(Ｈｉｒａｏｌａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)、气孔开闭( Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ.ꎬ 论基础ꎮ 本研究旨在探讨以下问题: ( １) ＶｖＦＴ１、
２０１１)、植 物 及 种 子 休 眠 ( Ｃａｒｍｏｎａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７ꎻ ＶｖＦＴ２ 和 ＶｖＣＢＦ 蛋白理化性质、结构及物种间的进
Ｖｅｒｇａｒａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６) 等 方 面 也 发 挥 重 要 作 用ꎮ 化关系ꎻ(２) 单氰胺破除葡萄休眠过程中 ＶｖＦＴ１、
ＣＢＦ 属于 ＡＰ２ / ＥＲＦ( ＡＰＥＴＡＬＡ２ / ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ＶｖＦＴ２ 和 ＶｖＣＢＦ 基因的表达模式变化ꎻ(３) 单氰胺
ｐｒｏｔｅｉｎ)类家族ꎬ能够与启动子中的核心片段相结 破除葡萄休眠过程中 ＣＡＴ、ＰＯＤ 和 ＳＯＤ 活性变化ꎬ
合从而调控相关基因的转录水平ꎬ目前 ＣＢＦ 被证 ＭＤＡ 和 Ｈ Ｏ 含量变化及氧自由基产生速率变化ꎮ
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明是植物抗冷途径的主要枢纽ꎬ通过调控下游大
量抗冷基因的表达ꎬ增强植物的抗冷能力( 吕胜男 １ 材料与方法
等ꎬ２０１１ꎻ赵峻丽等ꎬ２０２０)ꎮ 另外ꎬＣＢＦ 还在干旱、
高盐、极 端 高 温 等 非 生 物 胁 迫 方 面 起 重 要 作 用 １.１ 材料与试剂
(Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎬ以及还参与植物的生长( 赵 ‘水晶’葡萄来源于云南省弥勒市东风农场管
涛ꎬ２０１３)和休眠(Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)等过程ꎬ 理局的生长状况健康、一致的冬剪枝条ꎬ利用清水
但 目 前 ＣＢＦ 在 植 物 休 眠 方 面 的 研 究 较 少ꎮ 进行葡萄枝条扦插ꎬ每 ３ ｄ 对其喷施一次 ２.５％单氰
Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ 等(２０１１)将桃子 ＣＢＦ 转录因子转至苹 胺(刘芳ꎬ２０１８ꎻ邱栋梁等ꎬ２０２２)ꎬ以喷施清水作为
果中异位表达ꎬ首次发现该基因过表达导致短日 对照(ＣＫ)ꎬ分别在第 ０、第 ７、第 １４、第 ２１、第 ２８ 天
照诱导的休眠ꎻＳａｉｔｏ 等(２０１５) 研究发现 ＣＢＦ 可以 取‘水晶’葡萄芽立即利用液氮速冻后置于－８０ ℃
调 控 休 眠 相 关 ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ ( Ｄｏｒｍａｎｃｙ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ 超低温冰箱中保存ꎮ ＴＰＩｚｏｌ 提取液和 ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ
ＭＡＤＳ￣ｂｏｘꎬＤＡＭ) 基因ꎬ从而影响植物的休眠ꎬ并 Ｍａｒｋｅｒ 均购自宝日医生物技术(北京)有限公司ꎮ
且 ＦＴ 基因也参与此过程ꎮ 综上所述ꎬ ＣＢＦ 与 ＦＴ １.２ 生理指标的测定
基因均对植物休眠起到重要作用( Ｃａｒｍｏｎａ ｅｔ ａｌ.ꎬ 利用双组分光光度法和硫酸钛－浓氨水显色
２００７ꎻＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ꎻ Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ 法分别进行 ＭＤＡ 和 Ｈ Ｏ 含量的测定ꎬ利用盐酸羟
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Ｖｅｒｇａｒａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎬ并且联系紧密ꎬ但其是否也 胺法进行氧自由基产生速率的测定ꎬ利用氮蓝四
参与到单氰胺破除葡萄休眠这一过程中ꎬ值得深 唑法、愈创木酚法和紫外吸收法分别进行 ＳＯＤ、
入探讨ꎮ ＰＯＤ 和 ＣＡＴ 活 性 的 测 定 ( 邹 琦ꎬ ２０００ꎻ 高 俊 凤ꎬ
‘ 水 晶 ’ 葡 萄 ( Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ × Ｖ. ｌａｂｒｕｓｃａ ２００６ꎻ张志良等ꎬ２００９)ꎮ
‘Ｓｈｕｉｊｉｎｇ’)原产于美洲ꎬ成熟后呈黄绿色ꎬ具有肉 １.３ 葡萄芽总 ＲＮＡ 的提取和 ｃＤＮＡ 的合成
厚多汁、含糖量高、适口性好及可溶性固形物较高 取‘水晶’ 葡萄芽于研钵中ꎬ加入适量液氮研
等特点且有较高的营养价值(田竹希等ꎬ２０２１)ꎮ 单 磨成粉末后ꎬ取葡萄芽粉末迅速转移至 ２.０ ｍＬ 灭
氰胺常作为‘水晶’葡萄的破眠剂ꎬ促进葡萄提前萌 菌离心管中ꎬ加入 １ ｍＬ ＴＰＩｚｏｌ 提取液上下轻柔混
芽ꎬＣＢＦ 和 ＦＴ 作为植物打破休眠过程中重要的调 匀后ꎬ加入 ２００ μＬ 氯仿于室温放置 ５ ｍｉｎꎬ１２ ０００
控因子ꎬ还未见其基因序列及蛋白功能在‘水晶’葡 ｒｍｉｎ 、４ ℃ 条件下离心 １０ ｍｉｎꎻ取上清液于 １.５
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萄植物中被报道ꎬ因此本研究以‘ 水晶’ 葡萄为材 ｍＬ 灭菌离心管中ꎬ加入 ５００ μＬ 异丙 醇 后 混 匀ꎬ
料ꎬ进行单氰胺处理后ꎬ通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 技术克隆获得 １２ ０００ ｒｍｉｎ 、４ ℃ 条件下离心 １０ ｍｉｎꎬ倒去滤
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参与‘水晶’葡萄芽休眠的 ＣＢＦ 与 ＦＴ 基因 ｃＤＮＡ 全 液ꎻ加入 １ ｍＬ ７５％乙醇ꎬ用移液枪轻柔吹洗数下
序列ꎬ并利用实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ( ｑＲＴ￣ＰＣＲ) 技 后倒去乙醇( 该步骤重复 ２ 次)ꎬ室温下放置 ２ ~ ３
术对其进行表达量分析ꎬ以及结合喷施单氰胺后 ｍｉｎꎬ风干沉淀ꎬ加 ＤＥＰＣ 水 １００ μＬ 溶解 ＲＮＡꎬ用
‘水晶’葡萄芽内过氧化氢酶(ｃａｔａｌａｓｅꎬＣＡＴ)、过氧 移液枪轻柔吹洗混匀ꎬ置于－８０ ℃ 备用ꎮ ｃＤＮＡ 第
化 物 酶 ( ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬ ＰＯＤ ) 和 超 氧 化 物 歧 化 酶 １ 链使用 ＴａＫａＲａ 公司的 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ
( ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬ ＳＯＤ ) 活 性ꎬ 丙 二 醛 ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 试剂盒进行逆转录合成ꎬ方法
(ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅꎬＭＤＡ)和 Ｈ Ｏ 含量及氧自由基产 参照说明书ꎬ获得的 ｃＤＮＡ 马上进行后续 ＰＣＲ 扩
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生速率的测定分析ꎬ探讨单氰胺打破‘水晶’葡萄芽 增或置于－８０ ℃ 备用ꎮ
