Page 42 - 《广西植物》2024年第12期
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２ ２ ０ ０ 广 西 植 物 ４４ 卷
１.４ ＶｖＦＴｓ 和 ＶｖＣＢＦ 全长 ｃＤＮＡ 克隆 μＬꎬ２ μＬ 的 ｃＤＮＡꎬ３１.５ μＬ 的灭菌蒸馏水ꎮ ＰＣＲ
以 ＧｅｎＢａｎｋ 中 多 个 ＦＴ (ＧｅｎＢａｎｋ:ＪＮ２１４３５０. １、 扩增条件:９８ ℃ 预变性 ２ ｍｉｎꎻ９８ ℃ 变性 １０ ｓꎬ５８
ＫＰ０９９７１１.１、ＪＮ２１４３５１.１、ＫＦ８８１０１１.１)和 ＣＢＦ(ＧｅｎＢａｎｋ: ℃ 复性 １０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ６０ ｓꎬ３０ 个循环ꎻ最后 ７２ ℃
ＨＱ９０８６５３.１、ＪＸ４６４６６５.１、ＸＭ＿０２１９４７９６９.１、ＫＵ５８７０４３.１) 延伸 ２ ｍｉｎꎮ 扩增结束后ꎬＰＣＲ 产物在 １.０％ 琼脂
同源基因序列进行比对ꎬ使用 Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 设计引 糖凝胶上点样进行电泳检测ꎬ切胶回收获得的目
物并由生工生物工程(上海) 股份有限公司进行合 的 条 带ꎬ 利 用 Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ￣ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ ｆｏｒ
成ꎬ相关 引 物 碱 基 序 列 见 表 １ꎮ 使 用 高 保 真 酶 ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ 试剂盒在目的条带 ３′端添加 Ａ 碱基
®
® 后ꎬ连 接 ｐＭＤ２０￣Ｔ ｖｅｃｔｏｒ 载 体ꎬ 转 化 大 肠 杆 菌
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ
扩增体系(５０ μＬ):１０ μＬ 的 ５× ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＤＨ５ａ 感受态细胞ꎬ挑出阳性克隆送生工生物工程
２＋ ￣１
(Ｍｇ Ｐｌｕｓ)ꎬ４ μＬ 的 ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ(２.５ ｍｍｏｌＬ (上海)股份有限公司进行测序ꎬ最终获得 ２ 个‘ 水
ｅａｃｈ)ꎬ０. ５ μＬ 的 ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 晶’葡萄 ＦＴ 基因ꎬ分别命名为 ＶｖＦＴ１ 和 ＶｖＦＴ２ꎬ获
￣１
(２.５ ＵμＬ )ꎬ正向引物(Ｆ)和反向引物( Ｒ) 各 １ 得‘水晶’葡萄 ＣＢＦ 基因 １ 个ꎬ命名为 ＶｖＣＢＦꎮ
表 １ 本研究所用引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
基因 引物名称 引物碱基序列 (５′→３′) 产物大小 用途
Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→３′) Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｉｚｅ (ｂｐ) Ｐｕｒｐｏｓｅ
ＶｖＣＢＦ ＣＢＦ￣Ｆ ＡＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＴＣ ８２６ 基因扩增
Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＣＢＦ￣Ｒ ＣＣＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＡＴＧＴＴＣＧＡＣ
ＶｖＦＴ１ ＦＴ１￣Ｆ ＡＴＧＣＣＴＡＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣ ５２５
ＦＴ１￣Ｒ ＴＴＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣ
ＶｖＦＴ２ ＦＴ２￣Ｆ ＡＴＧＡＣＴＡＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＣＴＡＴＴＧＴＧＧ ５２５
ＦＴ２￣Ｒ ＴＴＡＴＣＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＴＣ
ＶｖＣＢＦ ｑＣＢＦ￣Ｆ ＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＧＣ ２６７ 实时荧光定量检测
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｑＣＢＦ￣Ｒ ＡＧＣＴＡＡＧＣＡＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＶｖＦＴ１ ｑＦＴ１￣Ｆ ＣＡＡＧＡＣＴＧＡＧＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧＣＡＴ ２２９
ｑＦＴ１￣Ｒ ＧＧＡＧＡＴＣＣＡＡＧＧＡＴＧＴＡＡＡＧＣＴＣ
ＶｖＦＴ２ ｑＦＴ２￣Ｆ ＣＣＴＴＴＧＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧ ２０１
ｑＦＴ２￣Ｒ ＣＣＣＴＣＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＡＧＴＡＧＡＣＧ
ＵＢＱ ｑＵＢＱ￣Ｆ ＧＡＣＡＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＡＡ １６１
ｑＵＢＱ￣Ｒ ＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＧＧ
１.５ ＶｖＦＴ１、ＶｖＦＴ２ 和 ＶｖＣＢＦ 基因生物信息学分析 测ꎻ使 用 ＮＣＢＩ 中 的 ＣＤＤ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ.
利用 ＤＮＡＭＡＮ ８ 进行碱基序列的比对和蛋白 ｎｉｈ.ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ) 数据库对蛋白的
质 序 列 翻 译ꎻ 使 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ｔｏｏｌ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. 保守结构域进行分析ꎻ使用 ＭＥＧＡ￣Ｘ 软件ꎬ采用相
ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 进行蛋白质分子量和理论 邻连接方法( Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ＪｏｉｎｉｎｇꎬＮＪ)、Ｐｏｉｓｓｏｎ 模型、
等电点分析ꎻ使用 ＧＯＲ４(ｈｔｔｐ: / / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ / Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ 模式建树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ 值取 １ ０００ꎬ
ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｇｏｒ４.ｈｔｍｌ) 和 进行系统进化树构建ꎮ
ＮｅｔＳｕｒｆＰ３. ０ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ / １.６ ＶｖＦＴ１、ＶｖＦＴ２ 和 ＶｖＣＢＦ 基因 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测
ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＮｅｔＳｕｒｆＰ￣３.０ / )在线工具预测蛋白二级结 用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＴＭ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ ( Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ
构ꎻ 使 用 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. Ｔｉｍｅ)试剂盒进行第 １ 链 ｃＤＮＡ 的逆转录合成后ꎬ
ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ)进行蛋白质三级结构在线预 再使 用 ＴＢ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ ( Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ
