Page 43 - 《广西植物》2024年第12期
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１２ 期           李小琴等: 单氰胺破除葡萄休眠生理生化响应及相关基因克隆与表达分析                                          ２ ２ ０ １

            Ｐｌｕｓ)进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 反应ꎬ操作方法参照说明书ꎮ                      可见ꎬ 可 通 过 喷 施 单 氰 胺 诱 导 葡 萄 芽 的 ＭＤＡ、
            以 ＵＢＱ 基因作为内参基因( 张永福等ꎬ２０２２)ꎬ对                       ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴ、Ｈ Ｏ 和氧自由基产生速率的生理
                                                                                ２  ２
            单氰胺诱导后的‘水晶’葡萄芽的 ＶｖＦＴ１、ＶｖＦＴ２ 和                      生化反应从而使葡萄打破休眠ꎬ提前萌发ꎬ在单氰
            ＶｖＣＢＦ 基因进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎬ引物序列见表 １ꎮ                    胺喷施‘水晶’葡萄后第 ２８ 天葡萄芽生长明显较
                                                               ＣＫ 长(图 ２)ꎮ
            ２  结果与分析                                           ２. ２ 葡 萄 ＶｖＦＴ１、 ＶｖＦＴ２ 和 ＶｖＣＢＦ 基 因 全 长
                                                               ｃＤＮＡ 克隆
            ２.１ 单氰胺喷施后‘ 水晶’ 葡萄芽中 ＭＤＡ、ＳＯＤ、                          为探明单氰胺破除‘水晶’ 葡萄休眠的分子机
            ＰＯＤ、ＣＡＴ、Ｈ Ｏ 和氧自由基产生速率变化                            制ꎬ本研究以单氰胺处理‘水晶’ 葡萄后第 ２８ 天的
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                 ＭＤＡ、ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＣＡＴ、Ｈ Ｏ 和氧自由基产生                   葡萄芽作为材料提取其总 ＲＮＡꎬ逆转录后获得其
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            速率生理生化指标是芽萌发的重要指标ꎬ在芽萌                              ｃＤＮＡ 为模板ꎬ用特异性引物进行 ＶｖＦＴ１、ＶｖＦＴ２ 和
            发的过程中起到重要作用ꎮ 本研究对单氰胺处理                             ＶｖＣＢＦ 基因的扩增ꎮ ＶｖＦＴ１ 和 ＶｖＦＴ２ 扩增出的大
            ‘水晶’葡萄芽后分别在第 ０、第 ７、第 １４、第 ２１、第                     小约为 ５００ ｂｐꎬＶｖＣＢＦ 扩增出的大小约为 ８００ ｂｐꎬ
            ２８ 天进行生理生化指标的测定(图 １)ꎮ 由图 １ 可                       均与目标基因大小一致( 图 ３)ꎮ 将 ＶｖＦＴ１、ＶｖＦＴ２
            知ꎬ单氰胺处理后葡萄芽的 ＭＤＡ 含量、ＳＯＤ 活性、                        和 ＶｖＣＢＦ 基因的克隆进行测序ꎬ最终获得 ＶｖＦＴ１
            ＰＯＤ 活性、ＣＡＴ 活性、Ｈ Ｏ 含量和氧自由基产生                        和 ＶｖＦＴ２ 的基因序列为 ５２５ ｂｐꎬＶｖＣＢＦ 基因序列
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            速率均在不同时期得到提升ꎮ 其中ꎬ单氰胺处理                             为 ８２６ ｂｐꎬ通过 ＤＮＡＭＡＮ ８.０ 分析得出 ＶｖＦＴ１ 和
            后葡萄芽的 ＭＤＡ 含量、Ｈ Ｏ 含量和氧自由基产生                         ＶｖＦＴ２ 基因编码 １７４ 个氨基酸(ａａ)ꎬＶｖＣＢＦ 基因在
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            速率在第 ０、第 ７、第 １４、第 ２１、第 ２８ 天呈先上升后                   第 ７１２ 至第 ７１５ 核苷酸为终止密码子ꎬ因此 ＶｖＣＢＦ
            降低的趋 势ꎻ 但 是 未 处 理 单 氰 胺 的 条 件 ( 对 照ꎬ               基因编码 ２３７ ａａꎮ
            ＣＫ)下ꎬＭＤＡ 含量、Ｈ Ｏ 含量和氧自由基产生速率                        ２.３ ＶｖＦＴ１ 和 ＶｖＦＴ２ 氨基酸序列的理化性质、蛋
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            在第 ０、第 ７、第 １４、第 ２１、第 ２８ 天呈上升趋势ꎮ 单                  白结构预测、进化树及其氨基酸保守结构域分析
            氰胺处理下ꎬ葡萄芽内 ＭＤＡ 含量在第 ２１ 天最高ꎬ                        ２.３.１ ＶｖＦＴ１ 和 ＶｖＦＴ２ 氨基酸序列的理化性质和
            Ｈ Ｏ 含量在第 ７ 天最高ꎬ氧自由基产生速率则在                          蛋白结构预测分析  利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ｔｏｏｌ 在线工具
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            第 １４ 天最高ꎮ 但值得注意的是ꎬ单氰胺处理后的                          对 ＶｖＦＴ１ 和 ＶｖＦＴ２ 基因的多肽链氨基酸数目、分
            ＭＤＡ 含量、ＳＯＤ 活性、ＰＯＤ 活性、ＣＡＴ 活性、Ｈ Ｏ                    子式、等电点、相对分子量等进行预测ꎮ ＶｖＦＴ１ 基
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            含量和氧自由基产生速率在第 ７、第 １４、第 ２１、第                        因共编码 １７４ ａａꎬ分子式为 Ｃ           Ｈ   Ｎ   Ｏ  Ｓ ꎬ分
                                                                                          ８７４  １３５９  ２４７  ２５６  ４
            ２８ 天均较 ＣＫ 高ꎮ 单氰胺喷施后 ＭＤＡ 含量在第                       子质量为 １９.５５ ｋＤａꎬ理论等电点( ｐＩ) 为 ８.８１ꎬ含
            ７、第 １４、 第 ２１、 第 ２８ 天 较 ＣＫ 分 别 提 高 了 ９８.            ２ ７４０个原子ꎻＶｖＦＴ２ 基因共编码 １７４ ａａꎬ分子式为
            ２０％、９６.２２％、９６. ０５％ 和 ４７. ２９％ ( 图 １: Ａ)ꎻ ＳＯＤ        Ｃ  Ｈ   Ｎ   Ｏ   Ｓ ꎬ分子质量为 １９. ４６ ｋＤａꎬｐＩ 为
                                                                ８５６  １３３５  ２４５  ２６３  ６
            和 ＰＯＤ 可通过分解活性氧来防止膜脂被氧化破                            ６.１１ꎬ含２ ７０５个原子ꎮ 利用 ＧＯＲ４ 和 ＮｅｔＳｕｒｆＰ ３.０
            坏ꎬ其活性与防止膜脂被氧化破坏的能力呈正相                              在线分析软件对 ＶｖＦＴ１ 和 ＶｖＦＴ２ 基因编码的蛋白
            关ꎬＳＯＤ 活性在第 ７、第 １４、第 ２１、第 ２８ 天较 ＣＫ 分                进行二级结构预测分析ꎬ结果显示在组成 ＶｖＦＴ１
            别提高了 ２３.５１％、４９.７３％、４５.８０％ 和５２.７８％ ( 图              蛋白的 １７４ 个氨基酸中ꎬ无规则卷曲占 ６２.６４％、α￣
            １:Ｂ)ꎬＰＯＤ 活性在第 ７、第 １４、第 ２１、第 ２８ 天较                  螺旋占 ９.７７％、折叠延伸链占 ２７.５９％( 图 ４:Ａ)ꎻ

            ＣＫ 分 别 提 高 了 ５９. ３４％、４１. ０３％、４０.５５％ 和 ４３.          在组成 ＶｖＦＴ２ 蛋白的 １７４ 个氨基酸中ꎬ无规则卷
            ００％(图 １:Ｃ)ꎻＣＡＴ 活性在第 ７、第 １４、第 ２１、第 ２８               曲占 ７０. １１％、 α￣螺 旋 占 ２. ３０％、 折 叠 延 伸 链 占
            天较 ＣＫ 分别提高了 ８０.８６％、１３６.１８％、１１５.２１％                 ２７.５９％( 图 ４:Ｂ)ꎮ 利用 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 在线工具
            和１００.６５％(图 １:Ｄ)ꎻＨ Ｏ 含量在第 ７、第 １４、第                  进行预测后发现ꎬＶｖＦＴ１( 图 ４:Ｃ) 和 ＶｖＦＴ２( 图 ４:
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            ２１、第 ２８ 天较 ＣＫ 分别提高了 ６７.５１％、３１.３１％、                 Ｄ)蛋白的结果也包括无规则卷曲、α￣螺旋和折叠
            ２０.８８％和 ２６.５１％(图 １:Ｅ)ꎻ氧自由基产生速率在                    延伸链ꎬ其中无规则卷曲含量ꎬ与二级结构预测结
            第 ７、 第 １４、 第 ２１、 第 ２８ 天 较 ＣＫ 分 别 提 高 了             果一致ꎮ 综上所述ꎬＶｖＦＴ１ 和 ＶｖＦＴ２ 基因编码的蛋
            １４９.４８％、１６１. ４１％、８０. ３９％ 和 ６. １３％ ( 图 １:Ｆ)ꎮ        白结构中占比由高到低均为无规则卷曲、 折叠延
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