Page 7 - 《广西植物》2024年第12期

１２ 期 史建磊等: 利用 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 技术创制番茄青枯病抗性基因 Ｓｌｍｌｏ１ / ６ 突变体 ２ １ ６ ５

２０２０)ꎮ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 显示两者均能在转录水平上响 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ
应番茄青枯病害( Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ 本研究以番 １.２ 试验方法
茄青枯病抗性突变体创制为对象ꎬ依托植物广谱 １. ２. １ 靶 点 设 计 与 载 体 构 建 利 用 在 线 工 具
抗性因 子 ｍｌｏ 和 番 茄 遗 传 转 化 体 系ꎬ 基 于 已 有 ＣＲＩＳＰＲ￣Ｐ２.０ ( ｈｔｔｐ:/ / ｃｂｉ. ｈｚａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ / ＣＲＩＳＰＲ２ / )
ＭＬＯ 生 物 信 息 学 和 基 因 定 量 表 达 研 究ꎬ 采 用 于目的基因第 １ 和第 ３ 外显子处设计 ２ 个 ＣＲＩＳＰＲ

ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑技术ꎬ通过构建 ＳｌＭＬＯ１ / ６ 靶位点ꎬ选取高效靶点设计引物( 表 １)ꎮ 将 ｇＲＮＡ
基因敲除载体并转化番茄ꎬ拟探讨以下问题:(１) 靶点序列复性形成 Ｏｌｉｇｏ 二聚体后ꎬ连接至经 Ｂｓａ Ｉ
番茄中 ＭＬＯ 的精准 敲 除 和 纯 合 突 变 体 的 创 制ꎻ 酶切的 ＣＲＩＳＰＲ 载体 ｐＢＧＫꎮ 反应体系如下:ｇＲＮＡ￣
(２)靶点突变类型和突变前后目的基因的表达变 Ｕ６ 片段 １ μＬ、Ｏｌｉｇｏ 二聚体 ０.３ μＬ、Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ ０.３ μＬ
化ꎻ(３)突变株的青枯病抗性表型ꎮ 旨在为抗青枯 和 Ｔ４ ＰＮＫ ０.１ μＬ ２３ ℃反应 １ ｈ 后ꎬ加 Ｔ４ ｌｉｇａｓｅ ０.３
病基因功能研究和品种改良提供理论基础和遗传 μＬ、ｄｄＨ Ｏ ４ μＬ 和 ｐＢＧＫ １ μＬ ２３ ℃ 连接反应 １ ｈꎮ
２
工程材料ꎮ 取 ５ μＬ 上述反应液ꎬ加入 ２０ μＬ 大肠杆菌 ＤＨ５α 感
受态细胞ꎬ混合后冰浴静置 ３０ ｍｉｎꎻ轻轻取出ꎬ４２ ℃
１ 材料与方法 热激 ３５ ｓꎬ立即置于冰上 ２ ｍｉｎꎻ加入 １００ μＬ ＬＢꎬ３７
℃振荡培养 １ ｈꎻ取 ６０ μＬ 菌液涂布于含 ５０ μｇ
１.１ 材料试剂 ｍＬ 卡那霉素的 ＬＢ 平板上ꎬ３７ ℃ 倒置培养过夜ꎮ
￣１
供试 番 茄 ( Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ) Ａｉｌｓａ Ｃｒａｉｇ 挑 选 阳 性 单 克 隆 送 样 测 序ꎮ 测 序 引 物 ＳＲ:
(ＡＣ)ꎬ是分子功能研究的模式品种ꎮ ＣＲＩＳＰＲ 系统 ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＧＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＴＡＣＧꎮ
ｐＢＧＫ 购自百格基因科技(江苏)有限公司ꎮ 大肠杆 １.２.２ 根癌农杆菌介导的遗传转化 利用冻融法转
菌 ( Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ) ＤＨ５α 和 根 癌 农 杆 菌 入根癌农杆菌 ＧＶ３１０１ꎬ经鉴定正确的单菌落用叶盘
(Ａｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ) ＧＶ３１０１ 为本实验室保存ꎮ 法转化番茄 ＡＣ (简兴等ꎬ ２０１５)ꎮ 主要操作如下:
Ｔｒｉｚｏｌ 总 ＲＮＡ 提取试剂盒、凝胶回收试剂盒、 １ / ２ ＭＳ 培养基播种番茄无菌种子ꎬ待子叶展开第一
荧光定量染料 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ 等购自生工生 片真叶还未出现时ꎬ剪取子叶进行预培养ꎬ根癌农
物工程 ( 上 海) 股 份 有 限 公 司ꎻ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、 杆菌侵染后共培养ꎬ转至潮霉素分化选择培养基ꎬ
ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶( Ｌｉｇａｓｅ)、Ｔ４ 多聚核 经 ３ 次继代培养后ꎬ将减去愈伤组织的芽转至生根
苷酸激酶(ＰＮＫ)等购自宝生物工程(大连) 有限公 培养基培养ꎬ待幼苗长至合适大小炼苗移栽ꎮ
司ꎻ限制性核酸内切酶 Ｂｓａ Ｉ 和 Ｓｐｈ Ｉ 购自 ＴａＫａＲａ １.２.３ 转化株靶点扩增与测序 提取转化单株幼
公司ꎻ卡那霉素和潮霉素购自鼎国生物公司ꎮ 培 嫩叶片基因组 ＤＮＡꎮ 根据目的基因序列设计引物
养基组分等所需生化试剂均为国产分析纯ꎮ ＰＣＲ (表 １)ꎬ对靶点区进行 ＰＣＲ 检测ꎮ 将扩增目的条

表 １ 所用引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物用途 基因 正向引物 (５′￣３′) 反向引物 (５′￣３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｕｓｅ Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ (５′￣３′) Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ (５′￣３′)
载体构建 ＳｌＭＬＯ１ ＴＧＡＴＴＧＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡＣＧＴＡＧＴＴＴ ＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＡＡＴＴＧＣＴＧＴＧＣＡ
Ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ＳｌＭＬＯ６ ＴＧＴＡＧＴＴＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＴＧＧＧＣＴＧＴＧＧＣ ＡＡＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＡＡＣ
靶点测序 ＳｌＭＬＯ１ ＡＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴＣ ＴＡＣＣＡＧＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＡ
Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ＳｌＭＬＯ６ ＡＡＡＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＣＴＡ ＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＡＡＡＣＧＣＡＡＡＡ
ＲＴ￣ｑＰＣＲ Ｓｌａｃｔｉｎ ＧＡＡＡＴＡＧＣＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡＣＧ ＡＴＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＡＧＴＡＴ

ＳｌＲＰＬ２ ＧＴＣＡＴＣＣＴＴＴＣＡＧＧＴＡＣＡＡＧＣＡ ＣＧＴＴＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣ
ＳｌＭＬＯ１ ＣＧＡＡＡＡＡＡＣＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＴ ＧＧＡＴＡＡＣＣＧＣＧＴＡＡＴＡＡＧＴＧＡＡ
ＳｌＭＬＯ６ ＧＧＧＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＴ ＧＧＡＴＴＣＣＴＴＧＡＡＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＴ