Page 8 - 《广西植物》2024年第12期
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２ １ ６ ６ 广 西 植 物 ４４ 卷
带进行纯化和测序ꎬ结合测序峰图及序列比对分
析突变类型ꎮ ＰＣＲ 扩增体系:１ μＬ ＤＮＡꎬ２ μＬ １０× ２ 结果与分析
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒꎬ０. ４ μＬ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅꎬ正 反 向 引 物 各
０.２ μＬꎬ０.２ μＬ Ｔａｑ 酶ꎬ加 ｄｄＨ Ｏ 补充至 ２０ μＬꎮ ２.１ 融合载体的构建与转化
２
扩增条件:９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５５ ＳｌＭＬＯ１ 靶点 １ 序列为 ＣＣＡＣＡＧＣＡＡＴＴＧＣＣＣＡ
℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ３０ ｓꎬ３０ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 ＣＧＴＡＧＧＧꎬ靶点 ２ 序列为 ＡＴＧＧＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＴＧＧ
１０ ｍｉｎꎮ ＣＡＡＡＧＧꎻＳｌＭＬＯ６ 靶点 １ 序列为 ＡＣＡＣＣＡＡＣＴＴＧＧ
１.２.４ 目的基因 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 检测 取样 ４ ~ ６ 叶期番 ＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧꎬ靶点 ２ 序列为 ＣＡＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧ
茄幼苗嫩叶ꎬ锡箔纸包裹置于液氮中ꎬ２ 次生物学 ＡＡＣＡＣＣＧＴＡＧＧꎬ靶点长 ２０ ｂｐ (图 １)ꎮ 对应的脱
重复ꎮ 提 取 野 生 型 和 突 变 株 ＲＮＡ 并 反 转 录 成 靶位点数分别为 ５ / ３１ 和２６ / ３３ꎬ因此双基因均选
ｃＤＮＡꎮ 以 Ｓｌａｃｔｉｎ 和 ＳｌＲＰＬ２ 为 内 参 基 因ꎬ 利 用 用第 １ 靶点ꎮ 融合载体命名为 ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１ / ６ꎬ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计定量引物(表 １)ꎮ ＲＴ￣ 含 Ｕ６ 启动子驱动表达的双基因靶点 ｇＲＮＡ 克隆
ｑＰＣＲ 反 应 体 系 包 括 ２ μＬ ｃＤＮＡꎬ ０. ４ μＬ ＰＣＲ 盒、３５Ｓ 启动子驱动表达的 Ｃａｓ９ 酶基因和潮霉素
ｐｒｉｍｅｒꎬ １０ μＬ ＳＹＢＲꎬ ７.２ μＬ ｄｄＨ Ｏꎮ 扩增程序为 (ＨＹＧ)筛选标记基因( 图 ２)ꎮ 回收 Ｓｐｈ Ｉ 酶切后
２
９５ ℃ ３ ｍｉｎꎻ ９５ ℃ ５ ｓꎬ ６０ ℃ ３０ ｓꎬ ４５ 个循环ꎬ整 的产物ꎬ经 ０.８％琼脂糖凝胶电泳分别得到 ５ ５００
体反应在 ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ 型荧光定量 ＰＣＲ 仪( ＡＢＩꎬ ｂｐ 和１０ ０００ ｂｐ 左右的两个条带( 图 ３)ꎬ与重组质
－ΔΔＣｔ 粒１５ ３８６ ｂｐ 大小相符ꎬ测序与设计靶点相同ꎬ表明
ＵＳＡ)中进行ꎬ采用 ２ 法计算基因相对表达量ꎮ
１.２.５ 苗期青枯病接种鉴定 番茄幼苗长至 ４ ~ ６ ２ 个靶点 ｇＲＮＡ 元件插入载体ꎮ 随后ꎬ融合载体经
片真叶时ꎬ剪伤部分根系ꎬ用浓度 ＯＤ ＝ １.０ 的青 根癌农杆菌介导的番茄遗传转化(图 ４) 和 ＰＣＲ 测
６００
枯菌液浸根 ２０ ｍｉｎꎬ３０ ℃ 条件下培养ꎬ第 ３ 天观察 序(图 ５)ꎬ最终获得 ９ 个编辑单株( Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、
植株抗性表型ꎮ Ｍ４、Ｍ６、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９、Ｍ１０)ꎮ
红色和紫色字母分别表示靶点序列和 ＰＡＭ 序列ꎮ
Ｔｈｅ ｒｅｄ ａｎｄ ｐｕｒｐｌｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ ＰＡＭ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
图 １ 目的基因中的 ２ 个 ｇＲＮＡ 靶点
Ｆｉｇ. １ Ｔｗｏ ｇＲＮＡ ｌｏｃｉ ｉｎ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ
ＲＢ. Ｔ￣ＤＮＡ 右边界ꎻ Ｕ６. 小 ＲＮＡ Ｕ６ 启动子ꎻ ｇＲＮＡ. 向导 ＲＮＡꎻ ３５Ｓ. 花椰菜花叶病毒 ３５Ｓ 启动子ꎻ ＮＯＳ. 终止子ꎻ ＨＹＧ. 潮霉
素ꎻ ｐｏｌｙＡ. 聚腺苷酸ꎻ ＬＢ. Ｔ￣ＤＮＡ 左边界ꎮ
ＲＢ. Ｔ￣ＤＮＡ ｒｉｇｈｔ ｂｏｕｎｄａｒｙꎻ Ｕ６. Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ Ｕ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ ｇＲＮＡ. Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡꎻ ３５Ｓ. ＣａＭＶ ３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ ＮＯＳ. Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒꎻ ＨＹＧ.
Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎꎻ ｐｏｌｙＡ. Ｐｏｌｙａｄｅｎｏｓｉｎｉｃ ａｃｉｄꎻ ＬＢ. Ｔ￣ＤＮＡ ｌｅｆｔ ｂｏｕｎｄａｒｙ.
图 ２ ＣＲＩＳＰＲ 融合载体 ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１/ ６
Ｆｉｇ. ２ ＣＲＩＳＰＲ ｆｕｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１/ ６
