Page 9 - 《广西植物》2024年第12期

１２ 期 史建磊等: 利用 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 技术创制番茄青枯病抗性基因 Ｓｌｍｌｏ１ / ６ 突变体 ２ １ ６ ７

２.２ 编辑株靶点序列突变型
测序结果表明ꎬ编辑植株 Ｍ１ 为 ＳｌＭＬＯ６ 杂合
突变体ꎻＭ２ 和 Ｍ８ 分 别 缺 失 １ 个 大 小 为 １７７ ｂｐ
(包括起始密码子ꎬ翻译 ＭＥＡＴＰＴＷＡＩＡＶＶＣＦＩＬＬＡ
ＩＳ)和 ７ ｂｐ ( ＧＧＧＣＡＡＴꎬ翻译 ＷＡＩ) 的 ＳｌＭＬＯ１ 基
因片段ꎬ而 ＳｌＭＬＯ６ 为杂合型突变ꎻＭ３ 和 Ｍ１０ 为
ＳｌＭＬＯ１ 杂合突变体ꎻＭ４ 和 Ｍ６ 均为双基因杂合突

变体ꎻＭ７ 缺失 １ 个大小为 １２ ｂｐ (ＣＡＡＣＴＴＧＧＧＣＴ
Ｇꎬ翻译 ＰＴＷＡＶ) 的 ＳｌＭＬＯ６ 基因片段ꎬ而 ＳｌＭＬＯ１
为杂合型突变ꎻＭ９ 基因 ＳｌＭＬＯ６ 位置 ３８２ ~ ３８３ 间
插入了 １ 个单碱基 Ｔ (翻译 Ｖ)ꎬ而 ＳｌＭＬＯ１ 为杂合

型突变(图 ５)ꎮ
２.３ 目的基因定量表达分析
基因定量表达结果表明ꎬ两个内参下ꎬ与野生
型(ＷＴ)相比ꎬ纯合突变株 Ｍ２ 和 Ｍ８ ＳｌＭＬＯ１ 表达
水平均极显著(Ｐ<０.０１) 下降ꎬ前者表达水平更低
Ｍ. ＤＬ１５ ０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ １. ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１ / ６ꎻ ２. 用 Ｓｐｈ Ｉ 酶切
但两者差异不显著( 图 ６:ＡꎬＣ)ꎮ 以 Ｓｌａｃｔｉｎ 为内
后的质粒 ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１ / ６ꎮ
Ｍ. ＤＬ１５ ０００ Ｍａｒｋｅｒꎻ １. ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１/ ６ꎻ ２. ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１/ ６ 参ꎬ纯合突变株 Ｍ７ 和 Ｍ９ ＳｌＭＬＯ６ 表达水平均极显
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｓｐｈ Ｉ. 著(Ｐ<０.０１)下降ꎬ前者表达水平更低且两者差异
图 ３ 重组质粒 ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１/ ６ 酶切电泳图 显著 ( 图 ６: Ｂ )ꎻ 以 ＳｌＲＰＬ２ 为 内 参ꎬ Ｍ７ 和 Ｍ９
Ｆｉｇ. ３ Ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＳｌＭＬＯ６ 表达水平均比野生型低ꎬ但显著性水平不
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＧＫ￣ＳｌＭＬＯ１/ ６
同ꎬ前者为极显著(Ｐ<０.０１)而后者为显著(Ｐ<０.０５)

Ａ. 子叶共培养 ２ ｄꎻ Ｂ－Ｅ. 筛选(芽分化)ꎻ Ｆ. 诱导生根 ２０ ｄꎮ
Ａ. Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｃｏ￣ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ２ ｄꎻ Ｂ－Ｅ. Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ (ｂｕｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｔｉｏｎ)ꎻ Ｆ. Ｒｏｏｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ２０ ｄ.
图 ４ 番茄的遗传转化
Ｆｉｇ. ４ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｍａｔｏ