Page 79 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 曾婉俐等: 烟草香气相关基因 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑突变体库的构建 １ ２ ７ ９

ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｂａｃｃｏ ｖａｒｉｅｔｙ ‘Ｈｏｎｇｈｕａ Ｄａｊｉｎｙｕａｎ’ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: (１) Ａｆｔｅｒ ｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ １００ ｓｇＲＮＡｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓꎬ
７７ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ １７２ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎｓꎬ ｗｉｔｈ ａ ｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ７７％. (２) Ａｍｏｎｇ ７７
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｇＲＮＡꎬ ６９ ｓｇＲＮＡｓ ｅｄｉｔｅｄ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓꎬ ｗｉｔｈ ａｎ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ８９.６％. (３) Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｓｇＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｏｆｆ￣ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｔ ａ ｎｏｎ￣ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ａ ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆ ｏｆｆ￣ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ. Ｉｎ ｓｕｍｍａｒｙꎬ ｉｔ ｉｓ ｆｅａｓｉｂｌｅ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏ￣
ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ ｖｅｃｔｏｒ ｌｉｂｒａｒｙ ｔｏ ｅｄｉｔ ａ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｏｂａｃｃｏ. Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ
ｈａｓ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅꎬ ｈｉｇｈ ｅｄｉｔｉｎｇ ｒａｔｅꎬ ａｎｄ ｌｏｗ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｏｆｆ￣ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｔｏｂａｃｃｏꎬ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ꎬ ｔａｂａｃｃｏ ａｒｏｍａꎬ ｏｎ￣ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇꎬ ｏｆｆ￣ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇ

ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑是一种在基因组水平 应 用 ( Ｓｃｈａｃｈｔｓｉｅｋ ＆ Ｓｔｅｈｌｅꎬ ２０１９ꎻ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ

上对 ＤＮＡ 序列进行定点改造的遗 传 操 作 技 术ꎮ ２０２３)ꎬ预示着该技术在未来烟草育种中蕴藏着巨
ＣＲＩＳＰＲ 基因编辑系统由 Ｃａｓ９ 核酸酶和引导 ＲＮＡ 大的潜力ꎮ
(ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡꎬ ｓｇＲＮＡ) 组 成ꎮ ｓｇＲＮＡ 的 一 段 烟草香味是烟叶及卷烟感官质量的重要指标
( ~ ２０ ｂｐ)与靶基因互补的 ＤＮＡ 序列可以特异性 之一ꎮ 烟草的香气前体物主要有质体色素、西柏烷
地识别靶 ＤＮＡꎬ而 Ｃａｓ９ 核酸酶对靶 ＤＮＡ 进行切 和赖百当类菇醇、酚类化合物、氨基酸和还原糖、脂
割ꎬ造成双链靶 ＤＮＡ 的断裂ꎬ诱发内源性 ＤＮＡ 的 类、生物碱六大类(汪耀富等ꎬ２００６)ꎮ 因其内在香

非同源末端修复机制( Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎮ ＤＮＡ 气前体合成相关基因的表达不同ꎬ不同烟草品种的
修复过程会引起 ＤＮＡ 核苷酸的缺失或增加等错 香气前体种类及含量不同(吕婧等ꎬ２０１４)ꎬ换言之ꎬ

配ꎬ导致基因移码突变ꎬ实现基因敲除ꎮ ＣＲＩＳＰＲ / 烟草香气前体种类和含量很大程度上由烟草本身
Ｃａｓ９ 基因编辑系统也可以对目的基因进行特定修 的遗传因素决定ꎮ 随着烟草基因组测序的完成ꎬ次
饰(如点突变和基因插入)ꎮ 例如ꎬ在 ＣＲＩＳＰＲ 基 生代谢产物相关合成酶的基因注释也日趋完善ꎮ
因敲除构建策略的基础上ꎬ添加计划插入修饰的 因此ꎬ从基因层面挖掘控制烟草香气前体物的关键

ＤＮＡ 片段即可对特定基因插入和替换遗传修饰ꎮ 基因ꎬ通过遗传操作改变相关基因的表达水平可以
ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑系统因其低成本、构 实现定向培育特定香味的烟草品种ꎮ 利用 ＣＲＩＳＰＲ￣
建简单和高效等优点ꎬ已经在人类、动物和植物等 Ｃａｓ９ 对烟叶香味基因进行高通量靶向突变ꎬ将为优
生物体中被广泛利用ꎬ目前已成为基因功能研究 异性状新种质的创建、重要功能基因的批量挖掘以

和基因定向修饰的一个有效工具( Ｋｎｏｔｔ ＆ Ｄｏｕｄｎａ 及烟草分子设计育种奠定基础ꎮ
２０１８ꎻ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ 在植物中的应用表明ꎬ 传统烟草育种工作主要靠多亲本多组合ꎬ也
ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 系统不仅可高效诱导产生 ＤＮＡ 突 就是将不同优良性状的烟草种质资源进行遗传整
变ꎬ而且诱导的突变可稳定遗传ꎮ 该技术可以在 合ꎬ构建优质烟草新品种ꎮ 但是ꎬ这种传统的杂交
基因组水平上对 ＤＮＡ 序列进行定点改造以创制 育种方式不仅耗费大量人力及财力ꎬ而且要耗费
优异种质资源ꎮ 例如:Ｌｉ 等(２０２３) 利用 ＣＲＩＳＰＲ / 多年时间ꎮ 一些优异性状因联锁累赘而无法整合
Ｃａｓ９ 基因编辑技术将普通烟草中 Ｎ’ 基因的抗性 在同一品种里ꎬ也在一定程度上限制了优异品种
核心区域精准替换为野生烟中 Ｎ’ ａｌａｔａ 基因的对 的创制ꎮ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑技术不仅可以不
应区域ꎬ使得栽培烟草获得了 ＴＭＶ￣Ｕ１ 抗性ꎻＱｉｎ 依赖于遗传杂交对紧密连锁的基因进行同时编
等(２０２１)利用 ＣＲＩＳＰＲ 技术对 ＮＩＣ 基因进行编辑 辑ꎬ还可以突破传统杂交育种无法将连锁优异位
产生了尼古丁含量极低的烟草新种质ꎻＣＲＩＳＰＲ / 点进行整合的限制ꎬ因此利用 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因
Ｃａｓ９ 基因编辑技术还可用于水稻和番茄等作物的 组编辑技术有望加速烟草香味品质改良ꎮ
快速驯化( Ｌｅｍｍｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８ꎻ Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８ꎻ 尽管基因编辑技术已被应用于构建水稻、玉
Ｙｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎬ为加快新品种的创制奠定了基 米等突变体库ꎬ但尚未应用于烟草基因突变体库
础ꎮ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑技术在烟草中的成功 的构建ꎮ 本研究以烟草栽培品种‘红花大金元’ 为