Page 81 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 曾婉俐等: 烟草香气相关基因 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑突变体库的构建 １ ２ ８ １

生代谢产物合成ꎬ离子吸收转运和信号转导等生
物学过程ꎮ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑技术可用来对特定
基因进行编辑以创制功能缺失突变体ꎮ ＣＲＩＳＰＲ /
Ｃａｓ９ 编辑系统由 Ｃａｓ９ 蛋白和 ｓｇＲＮＡ 组成ꎬ其中
Ｃａｓ９ 负责剪切 ＤＮＡꎬ而 ｓｇＲＮＡ 前端 ２０ 个碱基通

过碱基互补配对的方式识别靶位点ꎮ 靶位点的 ３′
端还应包含一个由 ３ 个碱基 ＮＧＧ( Ｎ 代表 ４ 种碱

基中的一种) 组成的原间隔相邻基序 ( ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ
ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆꎬＰＡＭ) 基序ꎮ 同一个基因通常有多
个靶位点可以选择ꎮ 为保证对特定基因的编辑特
异 性ꎬ 本 研 究 利 用 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 设 计 工 具

ＣＲＩＳＰＲ￣ＧＥ 为每个基因设计了特异性的靶位点ꎮ
为确保通过 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑获得的突变体为功
能缺失型突变体ꎬ靶位点设计在目标基因靠前的
外显子编码区区域( 图 １)ꎮ 针对同一个基因存在
多个不同转录本情况ꎬ靶位点选择在这些转录本
的共有外显子编码区域ꎮ 烟草属于异源四倍体植
物ꎬ某些基因通常存在一个序列高度相似的同源
基因ꎮ 对一些存在序列高度相似同源序列的基
因ꎬ设 计 工 具 有 时 无 法 设 计 靶 向 单 一 基 因 的
ｓｇＲＮＡ(单靶点 ｓｇＲＮＡ)ꎮ 针对这种情况ꎬ本研究
选择了可以同时靶向两个同源基因的 ｓｇＲＮＡ( 双
靶点 ｓｇＲＮＡ)ꎮ 由于靶位点的 ＧＣ 含量比例增加可
以提高编辑率ꎬ所以当存在多个可选靶位点时ꎬ本
研究选择了 ＧＣ 含量最高的靶位点(图 １)ꎮ
２.２ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 载体库构建 图 １ 候选基因的靶位点设计
在本研究所用的基因编辑载体中ꎬ烟草花叶 Ｆｉｇ. １ Ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｓ
病毒的 ３５Ｓ 启动子用来驱动 Ｃａｓ９ 基因ꎬ拟南芥的
Ｕ６￣２６ 启动子用来驱动 ｓｇＲＮＡ 骨架达ꎮ 载体上的 ２.３ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑分析
ｓｇＲＮＡ 前端预留了一段 ２０ ｂｐ 的插入序列ꎬ该序列 为 了 构 建 突 变 体 库ꎬ 本 研 究 将 上 述 的
包含两个 Ｂｓａ Ｉ 酶切位点(图 ２)ꎮ 载体经 Ｂａｓ Ｉ 酶 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 载体库转化农杆菌ꎬ然后通过叶盘
法转化烟草ꎬ再利用抗生素筛选后获得阳性转基
切后ꎬ产生两个特异性的黏性末端ꎬ可用来连入 ２０
ｂｐ 的靶位点序列ꎮ 根据方法中提及的靶位点引物 因烟 草 幼 苗ꎮ 由 于 转 基 因 植 物 携 带 了 Ｕ６￣２６ /
设计原则合成一对包含 ２０ ｂｐ 反向互补序列的引 ｓｇＲＮＡ 骨 架ꎬ 因 此 可 以 在 Ｕ６￣２６ 启 动 子 区 和
ｓｇＲＮＡ 区分别设计上、下游引物并通过 ＰＣＲ 测序
物ꎬ这一对引物经过退火反应后形成的双链 ＤＮＡ
获取阳性转基因植物的靶位点序列( 图 ３)ꎮ 根据
包含两个与载体匹配的黏性末端ꎮ 由于该 ＤＮＡ
的两个黏性末端恰好可以与编辑载体的黏性末端 提取的靶位点序列找到其对应的靶位点及靶基
完全匹配(图 ２)ꎬ所以可以通过 Ｔ４ ＤＮＡ 酶将片段 因ꎮ 在靶位点两侧设计特异性引物ꎬＰＣＲ 扩增后
与载体连接ꎮ 连接反应后ꎬ转化大肠杆菌ꎬ抗性板 测序ꎬ然后通过序列比对分析判断靶基因是否在
筛选菌斑ꎬＰＣＲ 扩增鉴定阳性克隆ꎬ测序正确后提 靶位点附近被编辑ꎮ 本研究从 １７２ 个转基因植株
取质粒ꎮ 通过该流程ꎬ本研究总共构建了 １００ 个 中鉴定到 ７７ 个不同 ｓｇＲＮＡ 的植株ꎮ 收获 Ｔ０ 代阳
ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 质粒ꎬ这些质粒按等比例混合后形 性植株 的 种 子 后ꎬ 种 植 Ｔ１ 代 植 株ꎬ 然 后 从 每 个

成了一个 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 载体库ꎮ ｓｇＲＮＡ 株系中选择 ７ 个单株进行靶位点测序分析ꎮ