Page 80 - 《广西植物》2024年第7期

１ ２ ８ ０ 广 西 植 物 ４４ 卷
材料ꎬ对其 １００ 个可能与烟草香味品质相关的功 Ｕ６￣Ｆ: ５′￣ＧＡＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ￣３′ꎬ 下 游 引
能基因进行靶向设计ꎬ构建 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 载体库 物为目的基因上靶位点的反向互补序列)ꎻ(５) 扩
并进行共转化ꎬ获得了烟草香味品质相关的基因 繁阳性菌斑ꎬ提取质粒ꎬ进行测序验证ꎮ
编辑突变体库ꎮ 基因靶向和脱靶分析表明ꎬ利用 １.４ 遗传转化

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ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 技术构建烟草突变库是切实可行的ꎮ 将 １００ 个质粒的浓度均调整为 ｌ００ ｎｇμＬ ꎬ
本研究旨在验证烟草高通量基因编辑技术的可行 每个取 １ μＬꎬ混匀ꎬ然后转化农杆菌 ＧＶ１３０１ꎬ涂布
性ꎬ为烟草基因功能研究和新种质创制提供新方 在含有卡那霉素和庆大霉素的 ＹＥＢ 培养基上ꎬ黑

法和新思路ꎮ 暗条件下 ２８ ℃ 培养 ３ ｄꎮ 用液体 ＹＥＢ 培养基洗脱
全部 菌 落ꎬ － ８０ ℃ 冻 存ꎬ 作 为 后 期 转 化 烟 草 的
１ 材料与方法 ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 编辑菌种ꎮ 烟草种子播种于育苗培
养皿中育苗ꎬ待长到 ４ 片叶子(约 ３０ ｄ)ꎬ便可将其
１.１ 实验材料 移入培养瓶中ꎬ于 ２６ ℃ 、１６ ｈ 光 / ８ ｈ 暗条件继续

本文以烤烟品种‘红花大金元’为实验材料ꎮ 培养 ３０ ｄꎬ备用ꎮ 在超净工作台中ꎬ用打孔器将叶
１.２ 靶位点序列设计 片打成直径 ５ ｍｍ 大小的圆形叶盘ꎮ 用 ４０ ｍＬ ＭＳ
香味相关候选基因的注释参考烟草基因组数 液体培养基将 ＹＥＢ 培养基活化的 ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 编
据 库 ＮＣＢＩ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｒｅｌｅａｓｅ 辑菌种悬浮成菌液(ＯＤ６００: ０.６ ~ ０.８) 置于 ５０ ｍＬ
１００ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｇｅｎｏｍｅ / 离心管内ꎮ 将叶盘转移到盛有菌液的 ５０ ｍＬ 离心
ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ＿ｅｕｋ / Ｎｉｃｏｔｉａｎａ＿ｔａｂａｃｕｍ / １００ / )ꎮ 利用在 管内ꎬ浸泡侵染 １０ ｍｉｎꎬ再平铺于 ＭＳ 固体培养基
线工具 ＣＲＩＳＰＲ￣ＧＥ( ｈｔｔｐ: / / ｓｋｌ. ｓｃａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ / ꎻ Ｘｉｅ 上ꎬ２８ ℃ ꎬ黑暗ꎬ 共培养 ３ ｄꎮ 之后将叶盘下表面
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)设计目标基因的特异靶位点ꎬ从候选 接触培养基ꎬ放置于含 ＮＡＡ( ０.０２ μｇｍＬ )、６￣
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靶位点中选择位于基因编码区前端的靶点ꎮ 依据 ＢＡ(０.５ μｇｍＬ )、羧苄青霉素(５００ μｇｍＬ )、
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靶位点设计和克隆原则设计引物ꎬ正向引物为 ５′￣ 卡那霉素(１００ μｇｍＬ ) 的 ＭＳ 培养基上ꎬ在(２８
ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＴＴ￣３′ꎬ反 向 引 物 ℃ ꎬ光照 １６ ｈ) / (２５ ℃ ꎬ黑暗 ８ ｈ) 条件下培养ꎬ至
为 ５′￣ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＡＴＣ￣３′ꎮ 其 长出分化芽(约 ２ 个月后)ꎬ切下分化芽(１ ~ ２ ｃｍ)
中ꎬ正向引物的 ２０ 个 Ｎ 是靶位点序列ꎬ反向引物 插入含有羧苄青霉素和卡那霉素的 ＭＳ 培养基上
的 ２０ 个 Ｎ 是靶位点序列的反向互补序列ꎬ引物退 进行生根培养ꎬ分化芽约 １０ ｄ 后出根ꎮ
火后的黏性末端恰好与载体 Ｂｓａ Ｉ 线性化后的载 １.５ 编辑素材的鉴定
体形成碱基互补配对ꎮ 为每个烟草单株编号ꎬ每个单株取少许叶片
１.３ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 载体构建方法 提取 ＤＮＡꎮ 用公共引物 (正向:５′￣ ＣＴＴＣＡＡＡＡＧＴ
以克隆一个基因的 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 载体为例: ＣＣＣＡＣＡＴＣＧＣＴＴＡＧ￣３′ꎻ 反向: ５′￣ＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＧ
(１)按照上述的引物设计原则ꎬ合成相应的正向引 ＴＧＧＡＴＣＡＧＣ￣３′)进行 ＰＣＲꎬ并用正向引物对产物
物和反向引物ꎻ(２)将正向引物和反向引物进行退 进行测序ꎮ 通过序列比对ꎬ提取相应单株的靶位

火反 应ꎬ 形 成 双 链 ＤＮＡ [ 退 火 反 应 体 系: ５ × 点序列ꎮ 根据靶点序列匹配相应的靶基因ꎬ并在
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ＤＮＡ Ｏｌｉｇｏｓ ４ μＬꎬ上下游引物 靶位点两侧设计靶基因的特异性引物ꎬ进行 ＰＣＲ
各 ４ μＬ(５０ μｍｏｌμＬ )ꎬＮｕｃｌｅａｓｅ￣ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ 补至 扩增ꎬ对 ＰＣＲ 产物测序ꎮ 通过序列比对分析相应
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２０ μＬꎮ 反应程序: ９５ ℃ ５ ｍｉｎꎬ每 ８ ｓ 下降 ０. １ 单株的靶位点是否被编辑ꎮ
℃ ꎬ直至 ２５ ℃ (约 ９０ ｍｉｎ)ꎬ４ ℃ 保存]ꎻ(３)将退火
２ 结果与分析
反应得到的产物连接到经 Ｂｓａ Ｉ 酶切的 ＣＲＩＳＰＲ /
Ｃａｓ９ 载体 ｐＯＲＥ￣Ｃａｓ９ / ｇＲＮＡ 上 [ 连接体系:退火

产物 ２ μＬꎬ 酶 切 产 物 ３ μＬꎬ １０ × Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ２.１ 靶位点设计
Ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬꎬＴ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ(４００ ＵμＬ )１ μＬꎬ无 根据烟草基因组的功能注释以及文献调研ꎬ
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菌水补至 ２０ μＬ]ꎻ(４) 连接产物转化 ＤＨ５α 受态 本研究选择了 １００ 个可能参与烟草香气前体物质
细胞ꎬ利用菌落 ＰＣＲ 筛选阳性克隆( 上游引物为 合成相关的基因( 图 １)ꎬ它们编码的蛋白参与次