Page 82 - 《广西植物》2024年第7期
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图 ２ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑突变体库构建流程
Ｆｉｇ. ２ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ ｅｄｉｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｌｉｂｒａｒｙ
测序结果表明ꎬ在 ６１ 个单靶点 ｓｇＲＮＡ 中ꎬ５５ 个有靶
向编辑ꎬ６ 个没有靶向编辑ꎻ在 １６ 个双靶点 ｓｇＲＮＡ
中ꎬ１３ 个靶向编辑了双靶基因ꎬ１ 个靶向编辑了 ２ 个
靶基因的其中 １ 个ꎬ２ 个未靶向编辑靶基因(表 １)ꎮ
ｓｇＲＮＡ 的靶向编辑率为 ８９.６％(６９ / ７７)ꎮ
２.４ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 脱靶编辑分析
为了评估编辑植株中是否存在脱靶编辑的情
况ꎬ本研究利用 ＢＬＡＳＴ 软件预测了 ７７ 个 ｓｇＲＮＡ
的潜在脱靶位点ꎮ 已有研究表明ꎬｓｇＲＮＡ 与脱靶
位点的碱基错配数量大于 １ 个就可以阻止该位点
被编辑ꎬ而 １ 个碱基错配仍有较大可能会导致脱
靶编辑发生( Ｎａｅｅｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎬ因此本研究只
分析了存在 １ 个错配碱基的脱靶位点是否被编
辑ꎮ 在获得的 ７７ 个 ｓｇＲＮＡ 中ꎬ２０ 个 ｓｇＲＮＡ 有 １
个脱靶位点ꎬ１ 个 ｓｇＲＮＡ 有 ２ 个脱靶位点( 表 １)ꎮ
图 ３ 阳性植株 ｓｇＲＮＡ 序列的扩增
在脱靶位点两侧设计特异性引物后进行 ＰＣＲ 扩增
Ｆｉｇ. ３ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｇＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ
测序ꎬ结果表明只有 １ 个 ｓｇＲＮＡ 的脱靶位点被编
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ
辑(图 ４)ꎮ
