Page 87 - 《广西植物》2024年第7期

７ 期 曾婉俐等: 烟草香气相关基因 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 编辑突变体库的构建 １ ２ ８ ７

编辑突变体库的方法中ꎬ共转化率、编辑率和脱靶
编辑率是研究人员比较关注的问题ꎮ 本研究结果
表明ꎬ烟草的共转化率可以达到 ７７％ꎬ因此可以获
得大多数载体的转基因烟草ꎬ这保证了烟草基因
突变体库的高覆盖率ꎮ 烟草的转基因通过愈伤组
织转化实现ꎬ单次转化的基因编辑率高ꎮ 本研究
证明ꎬ共转化多基因编辑载体同样可以实现较高
的基因编辑率(８９.６％)ꎮ ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 基因编辑
技术潜在的脱靶作用是制约其应用的一个主要因
素ꎮ 本研究进行了脱靶位点分析ꎬ结果显示ꎬ７７ 个
图 ４ 一个 ｓｇＲＮＡ 的脱靶编辑 ｓｇＲＮＡ 中只有 １ 个位点产生了脱靶编辑ꎬ这说明
Ｆｉｇ. ４ Ｏｆｆ￣ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｏｎｅ ｓｇＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 对靶位点的识别具有很强的特异性ꎮ
由于本研究未进行全基因组测序分析ꎬ所以不能
３ 讨论 排除编辑植株仍然存在脱靶编辑的可能性ꎮ 值得
提及的是ꎬ在编辑植物中总能筛选到 Ｃａｓ９ 基因与
烟草的香味来源于在烟叶片中合成并累积的 编辑位点位于不同染色体上的植株ꎬ在育种实践
香味化学成分ꎮ 香味相关成分的含量和种类受到 中可以通过遗传分离和纯化选择去除转基因标签
相关代谢途径基因的类型及表达水平的控制ꎮ 受 或脱靶编辑位点ꎮ
限于烟草种质资源遗传基础方面的研究不足ꎬ烟
草香味品质相关代谢物合成的基因尚未被大规模 ４ 结论
鉴定ꎮ 烟草基因组测序和基因功能注释的完成为
烟草香味的研究提供了新动力ꎮ 本研究利用生物 本研究利用 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 技术成功构建了烟
信息学分析获得了 １００ 个与烟草香味品质相关的 草香味相关基因的突变体库ꎬ表明 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９
基因ꎬ研究这些基因的功能可为后续改善烟草香 基因编辑技术高通量编辑烟草基因可用于构建烟
味品质提供基因资源ꎮ 草突变体库ꎬ该方法具有共转化率高、靶向编辑率
确定某个基因是否与烟草香味相关并对其功 高和脱靶编辑率低等特点ꎮ 本研究为烟草香味功
能进行解析很大程度上依赖于相关基因突变体的 能基因的研究提供了遗传资源ꎬ为烟草香味重要
研究ꎮ 基于 ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ９ 的基因编辑技术日趋成 性状的分子改良提供了种质资源ꎮ 该技术方法并
熟ꎬ利用该技术研究和创制不同香味品质的烟草种 不是仅限于构建烟草香味品质相关基因的突变体
质资源对于烟草工业的可持续发展尤为重要ꎮ 利 库ꎬ而是可用于在烟草中构建研究人员感兴趣的
用 ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 基因编辑技术高通量构建突变体 任何性状的基因突变体库ꎬ这将加速烟草功能基

库已经应用于水稻( Ｌｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７ꎻ Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ 因的研究ꎮ
２０１７ꎻ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ )、 番 茄 ( Ｊａｃｏｂｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ
２０１７)、玉米( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０) 和大豆( Ｂａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ
参考文献:
２０２０)等二倍体植物ꎮ 本研究成功将 ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９
基因编辑技术应用于四倍体植物烟草突变体库的
ＢＡＩ Ｍꎬ ＹＵＡＮ Ｊꎬ ＫＵＡＮＧ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０. Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
构建ꎮ 最近ꎬＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 基因编辑技术已成功应
ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ｐｏｏｌｅｄ ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ ｉｎ
用于油菜突变体库的构建(Ｈｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３)ꎬ这也是
ｓｏｙａ ｂｅａｎ [Ｊ]. Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｊꎬ １８(３): ７２１－７３１.
该技术首次应用于十字花科的异源四倍体植物ꎮ
ＣＨＥＮ Ｋꎬ ＫＥ Ｒꎬ ＤＵ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２. Ａ ＦＬＡＳＨ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｆｏｒ
本研究的编辑对象烟草是茄科的异源四倍体植物ꎬ
ａｒｒａｙｅｄ ＣＲＩＳＰＲ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ
该突变体库的成功构建为在茄科多倍体植物中开
ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｒｉｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ￣ｌｉｋｅ ｋｉｎａｓｅｓ [ Ｊ]. Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔꎬ
展高通量靶向编辑提供了一个成功的案例ꎮ １５(２): ２４３－２５７.
在利用农杆菌共转化获得 ＣＲＩＳＰＲ￣Ｃａｓ９ 基因 ＣＨＥＮ Ｋꎬ ＷＡＮＧ Ｙꎬ ＺＨＡＮＧ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９. ＣＲＩＳＰＲ/ Ｃａｓ