Page 116 - 《广西植物》2025年第10期

１ ８ ４ ６ 广 西 植 物 ４５ 卷
技术的推广应用ꎮ 室内花盆中培育ꎬ生长高度在 １０ ｃｍ 以上ꎮ
徐志周等(２０１９) 研究表明由于生防菌产次级 １.２ 培养基
代谢产物具有不稳定的特点ꎬ为使生防菌更高效应 马 铃 薯 葡 萄 糖 肉 汤 ( ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈꎬ
用于农业生产ꎬ因此筛选得到最佳发酵配方及发酵 ＰＤＢ)培养基、营养琼脂( ｎｕｔｒｉｅｎｔ ａｇａｒꎬ ＮＡ) 培养
条件成为提高生防菌对植物病原菌抑制作用的首 基、营养肉汤(ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｂｒｏｔｈꎬ ＮＢ) 培养基均购自广
要任务ꎮ 然而ꎬ目前针对广藿香青枯病的生防真菌 东环凯微生物科技有限公司ꎮ
资源仍十分匮乏ꎬ特别是缺乏兼具高效抑菌活性和 愈伤组织诱导培养基:ＭＳ 基本培养基 ４.７４ ｇꎬ
￣１
￣１
改善植物生理特性的菌株ꎮ Ｌｉ 等(２０２２)研究表明ꎬ 蔗糖 ３０ ｇꎬ６￣ＢＡ ０.２ ｍｇＬ ꎬＮＡＡ ０.１ ｍｇＬ ꎬ琼
穿心莲内生真菌 ＡＰ￣１２ 对多种病原菌(如金黄色葡 脂 ７ ｇꎬ 蒸 馏 水１ ０００ ｍＬꎬ ｐＨ ５. ８ꎮ 生 根 培 养 基:
萄球菌、枯草芽孢杆菌等)具有显著抑制作用ꎬ并能 １ / ２ＭＳ基本培养基 ２.４７ ｇꎬ蔗糖 ３０ ｇꎬＩＢＡ ０.２ ｍｇ
￣１
合成具有重要药用价值的穿心莲二萜内酯类成分ꎬ Ｌ ꎬ琼脂 ７ ｇꎬ蒸馏水１ ０００ ｍＬꎬｐＨ ５.８ꎮ
显示出良好的抗菌活性和代谢产物多样性ꎮ 然而ꎬ １.３ 主要试剂和仪器
ＡＰ￣１２ 在培养过程中易发生退化ꎬ严重制约了其开 试剂:丙二醛( ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅꎬ ＭＤＡ) 测定试
发利用ꎮ 此外ꎬ关于 ＡＰ￣１２ 在植物病害防治中的应 剂 盒、 超 氧 化 物 歧 化 酶 ( ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬ
用潜力尚未得到充分探索ꎬ特别是针对广藿香青枯 ＳＯＤ)试剂盒、过氧化物酶( ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬ ＰＯＤ) 试剂
病这一严重威胁中药材生产的土传病害ꎬ尚未见相 盒、过氧化氢酶(ｃａｔａｌａｓｅꎬ ＣＡＴ)试剂盒均购自南京
关研究报道ꎮ 建成生物工程研究所ꎻ广藿香酮标准品购自北京
基于当前广藿香青枯病防治中存在的生防菌 索莱宝科技有限公司ꎻ红四氮唑购自上海麦克林
应用瓶颈(防效不稳定、宿主生理影响不明)ꎬ本研 生化科技股份有限公司ꎻ乙酸乙酯、甲醇购自天津
究拟重点探究:(１)如何通过优化发酵培养基配方 致远化学试剂有限公司ꎮ
(碳源、氮源)及发酵条件(装液量、ｐＨ、发酵时间) 仪器:ＣＴ￣８８４ 全自动立式蒸汽灭菌器( 上海驰
提高 ＡＰ￣１２ 的抑菌活性稳定性ꎻ(２) ＡＰ￣１２ 发酵液 通仪器有限公司)ꎻＨＺＱ￣Ｘ３００ 恒温培养摇床(上海
对广藿香青枯病的实际防效及其作用方式ꎻ( ３) 一恒科学仪器有限公司)ꎻＲＥ￣５２ＡＡ 旋转蒸发仪
ＡＰ￣１２ 处理对广藿香植株生理生化响应及药用成 (上海亚荣生化仪器厂)ꎻＢＧＰＸ￣３００ 光照培养箱
分积累的影响机制ꎮ 通过建立“发酵工艺优化－防 (山东博科科学仪器有限公司)ꎻ７８９０Ｂ 气相色谱－
效评价－生理调控” 的研究体系ꎬ旨在阐明内生真 质谱仪(美国安捷伦科技公司)ꎻＯＫ￣Ｙ１０４ 植物营
菌在植物病害防治中的多重作用机制ꎮ 养测定仪( 郑州欧科奇仪器制造有限公司)ꎻＲＴ￣
２１００Ｃ 酶标仪(赛默飞世尔科技公司)ꎮ
１ 材料与方法 １.４ 菌株 ＡＰ￣１２ 培养条件的优化

１.４.１ 发酵培养基碳源筛选 以马铃薯浸出液为
１.１ 样品 基础培养基ꎬ取 ４００ ｍＬ 分装于 ５００ ｍＬ 锥形瓶中ꎬ
穿心莲种子由广西贵港种植基地提供ꎬ经广 分别添加质量浓度为 ２０ ｇＬ 的不同碳源( 葡萄
￣１
州中医药大学药用植物学教研室杜勤教授鉴定为 糖、蔗糖、麦芽糖、果糖)ꎬ用 ６ ｍｍ 无菌打孔器打取
穿心莲( Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ) 的成熟种子ꎮ 将 ＡＰ￣１２ 菌饼 ３ 个 接 种 于 培 养 基 中ꎬ 在 ２８ ℃ 、１５０
种子播种于育苗穴盘ꎬ待出现 ４ 片真叶时移栽至 ｒｍｉｎ 摇床中培养 １０ ｄꎮ
￣１
试验田中培育成株ꎬ内生真菌 ＡＰ￣１２ 由叶片中分 将发酵 产 物 真 空 抽 滤ꎬ以 分 离 得 到 发 酵 液ꎮ
离得到ꎬ为该课题组(Ｘｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３) 前期分离且 将发酵液在旋转蒸发仪上以 ４５ ℃ 、５５ ｒｍｉｎ 的
￣１
保存ꎬ 经 鉴 定 为 刺 盘 孢 属 真 菌 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ. 条件旋至 １００ ｍＬꎬ按 Ｖ 乙酸乙酯 ∶ Ｖ 发酵液 ＝ １ ∶ １ 混合萃
(ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ: ＯＬ４７７５８１.１)ꎮ 取ꎬ直至乙酸乙酯层无色ꎮ 合并乙酸乙酯层ꎬ以相
青枯菌 ＧＤＭＣＣ １.７１ 购自广东省微生物菌种 同条件在旋转蒸发仪上旋干ꎬ加入甲醇溶解以制
￣１
保藏中心ꎮ 备 ２０ ｍｇｍＬ 发酵提取液ꎮ 将青枯菌以无菌水
广藿香叶片采自广州中 医 药 大 学 时 珍 山 药 制成菌悬液ꎬ调整菌液浓度至 １×１０ ＣＦＵｍＬ 备
￣１
６
圃ꎬ通过组培技术繁育得到广藿香组培苗ꎬ移栽于 用ꎮ 采用牛津杯法( 朱君等ꎬ２０２３) 测定发酵提取