Page 117 - 《广西植物》2025年第10期
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１０ 期 黄瑾等: 穿心莲内生真菌 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ. ＡＰ￣１２ 培养条件优化及防治广藿香青枯病 １ ８ ４ ７
液对青枯菌的抑菌能力ꎬ根据抑菌圈大小确定最 液分成两部分ꎬ一部分不做处理ꎬ另一部分于 １２１ ℃
佳碳源ꎮ 下高压灭菌 ２０ ｍｉｎꎬ分别将两部分用无菌水稀释 ２
在筛选出最适碳源的基础上ꎬ设置质量浓度 倍ꎬ即为发酵液和灭菌发酵液ꎬ用于后续试验ꎮ
为 １０、２０、３０、４０、５０ ｇＬ 的最适碳源ꎬ通过比较 １.６ 盆栽防效试验
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抑菌活性确定最适碳源添加量ꎮ 参考曹嵩晓等(２０１１) 的方法ꎬ通过叶片诱导
１.４.２ 发酵培养基氮源筛选 取优化碳源后的培 获得广藿香组培苗ꎬ当株高为 ５ ~ ６ ｃｍ 时ꎬ进行炼
养基分别加入质量浓度为 １０ ｇＬ 的不同种类氮 苗处理ꎬ随后移栽至装有营养土的花盆中ꎬ连续浇
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源(酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、豆粉)ꎬ方法同 １.４.１ꎬ 水培养 １ 周后ꎬ用于后续接种试验ꎮ
筛选最适种类氮源ꎮ 设置质量浓度为 １０、１５、２０、 采用泥炭土 ∶ 蛭石 ∶ 珍珠岩(３ ∶ １ ∶ １) 混合
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２５、３０ ｇＬ 的最适氮源ꎬ确定最适氮源添加量ꎮ 基质ꎬ经 １２１ ℃ 灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ 试验共设 ４ 个处理:
后续试 验 利 用 优 化 碳 源、 氮 源 后 的 最 佳 发 酵 培 (１)ＣＫ 为每盆添加 ２０ ｍＬ 无菌水ꎻ(２)Ｒ 为每盆采
养基ꎮ 用伤根灌根法施加 ２０ ｍＬ 青枯菌液( ＯＤ ＝ １.５)ꎻ
６００
１.４.３ 装液量对菌株 ＡＰ￣１２ 抑菌活性的影响 将 (３)ＦＲ 为每盆添加 ２０ ｍＬ 发酵液预处理 １２ ｈ 后ꎬ
ＡＰ￣１２ 菌饼接种于装液量为 １００、２００、３００、４００ ｍＬ 接种 ２０ ｍＬ 青枯菌液ꎻ(４) ＭＦ 为每盆添加 ２０ ｍＬ
的最佳发酵培养基中ꎬ恒温摇床中发酵培养 １０ ｄ(２８ 灭菌发酵液预处理 １２ ｈ 后ꎬ接种 ２０ ｍＬ 青枯菌液ꎮ
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℃、１５０ ｒｍｉｎ )ꎬ方法同 １.４.１ꎬ确定最适装液量ꎮ 每个处理 ９ 盆ꎬ植株培养条件为 ３０ ℃ 、６０％ＲＨ、１２
１.４.４ ｐＨ 对菌株 ＡＰ￣１２ 抑菌活性的影响 分别将 ｈｄ 光照ꎮ 观察发病 ７ ｄ 时广藿香根、茎、叶的状
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最佳发酵培养基的 ｐＨ 调节为 ５.０、６.０、７.０、８.０ꎬ在 态ꎬ并在体视显微镜下观察茎横切面的形态ꎮ 盆
￣１ 栽试验共进行 ７ ｄꎬ于侵染 ７ ｄ 内进行发病调查ꎬ统
恒温摇床中发酵培养 １０ ｄ(２８ ℃ 、１５０ ｒｍｉｎ )ꎬ
将 ＡＰ￣１２ 菌饼接种于上述最适装液量的最佳发酵 计病情指数和防治效果ꎮ 广藿香青枯病分级标准
培养基中ꎬ方法同 １.４.１ꎬ确定最适 ｐＨ 值ꎮ 参照中华人民共和国国家标准 ＧＢ / Ｔ ２３２２２—２００８
１.４.５ 发酵时间对菌株 ＡＰ￣１２ 抑菌活性的影响 调节 (李信申等ꎬ２０１９)ꎮ 其中ꎬ病情指数和防治效果计
最佳发酵培养基至最适 ｐＨꎬ将 ＡＰ￣１２ 菌饼接种于 算公式如下:
上述最适装液量的最佳发酵培养基中ꎬ在恒温摇 病情指数 (％) ＝ ∑ ( 各 级 病 株 数 × 各 级 严 重
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床以 ２８ ℃ 、１５０ ｒｍｉｎ 的条件发酵培养 ６、８、１０、 度) / (调查总株数×最高严重度) ×１００ꎻ
１２ ｄꎬ方法同 １.４.１ꎬ确定最适发酵时间ꎮ 防治效果(％)＝ ( 对照组病情指数－处理组病
１.４.６ 菌株 ＡＰ￣１２ 正交试验设计 以确定的最佳 情指数) / 对照病情指数×１００ꎮ
碳源、氮源为基础ꎬ选择装液量( Ａ)、最佳碳源浓 １.７ 广藿香植株生理生化指标及有效成分含量的
度(Ｂ)、最佳氮源浓度(Ｃ)及 ｐＨ(Ｄ)４ 个因素进行 测定
优化试验ꎮ 每个因素设置 ３ 个水平ꎬ组成 ４ 因素 ３ １.７.１ 叶片生理指标 在施加青枯菌液的 ３、７ ｄ 时ꎬ
水平试验ꎬ使用 ＳＰＳＳ 进行正交试验设计ꎬ确定组 采用植物营养测定仪测定 ４ 个处理组(ＣＫ、Ｒ、ＦＲ、
合方式进行试验ꎮ ９ 个处理分别置于相应的培养 ＭＦ)从上往下第 ２ 对叶片的叶绿素含量和氮含量ꎮ
条件下进行发酵培养 ８ ｄ(２８ ℃ 、１５０ ｒｍｉｎ )ꎬ方 １.７.２ 叶片 ＣＡＴ、ＰＯＤ、ＳＯＤ 酶活力及 ＭＤＡ 在施加
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法同 １.４.１ꎬ测定抑菌活性ꎬ３ 次重复ꎮ 对正交结果 青枯菌液的 ３、７ ｄ 时ꎬ采用钼酸铵法测定 ＣＡＴ 酶活
进行极差分析和方差分析ꎬ经综合分析确定最佳 力、愈创木酚法测定 ＰＯＤ 酶活力、氮蓝四唑还原法
发酵组合ꎮ 测定 ＳＯＤ 酶活力、硫代巴比妥酸法测定 ＭＤＡ 含量ꎮ
１.５ 青枯菌液和内生真菌 ＡＰ￣１２ 发酵液的制备 １.７.３ 叶片有效成分 参考 Ｗａｎｇ 等(２０２３) 的方
挑取青枯菌单菌落接种于 １５０ ｍＬ ＮＢ 培养液 法ꎬ在施加青枯菌液的 ３、７ ｄ 时ꎬ使用 ＨＰ￣５ＭＳ (３０
的 ２５０ ｍＬ 锥形瓶中ꎬ３０ ℃、２００ ｒｍｉｎ 条件下摇瓶 ｍ × ０.２５ ｍｍ × ０.２５ μｍ)色谱柱的气相色谱－质谱
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培养 １２ ｈ 后ꎬ用无菌水调整菌液浓度至 ＯＤ ＝ １.５ꎮ 仪测定广藿香叶片中广藿香酮成分含量ꎮ
６００
参考 Ｘｕ 等(２０２３) 的方法ꎬ将穿心莲内生真菌 １.７.４ 根系活力 参考李合生等(２０００) 的方法ꎬ在
ＡＰ￣１２ 打取菌饼ꎬ在上述得到的最佳发酵工艺下培 施加青枯菌液的 ３、７ ｄ 时ꎬ采用 ＴＴＣ 还原法测定广
养ꎮ 经真空抽滤后滤除菌丝ꎬ得到发酵液ꎮ 将发酵 藿香的根系活力ꎮ
