Page 155 - 《广西植物》2025年第10期

１０ 期 杜明阳等: 蒿叶猪毛菜 ＳａＧＰＡＴ１ 基因克隆与表达分析 １ ８ ８ ５

１.２.５ 干旱胁迫下 ＳａＧＰＡＴ１ 基因的转录组表达分析
利用蒿叶猪毛菜幼苗干旱胁迫处理 ３ ｄ 后(处理 ２ 结果与分析
组)与正常生长 ３ ｄ(对照组) 的转录组数据ꎮ 以每
百万映射读数中每千碱基的片段数( ＦＰＫＭ 值) 计 ２.１ ＳａＧＰＡＴ１ 基因的克隆

算 ＳａＧＰＡＴ１ 基因的表达量并进行显著性差异分析ꎬ 以蒿叶猪毛菜整株幼苗提取 ＲＮＡꎬ使用凝胶
结果利用 ＴＢｔｏｏｌｓ 进行可视化处理(热图)ꎮ 电泳检测质量合格后进行反转录获得 ｃＤＮＡꎬ通过
１.２. ６ ＳａＧＰＡＴ１ 基 因 的 表 达 水 平 分 析 为 分 析 蒿叶猪毛菜幼苗干旱胁迫转录组数据筛选出待鉴
ＳａＧＰＡＴ１ 基因在不同组织及不同发育阶段中的表 定的 ＳａＧＰＡＴ１ 基因序列并设计相应的引物克隆
达情况以及验证蒿叶猪毛菜幼苗干旱胁迫转录组 ＳａＧＰＡＴ１ 基因ꎬ利 用 １. ０％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 验
数据的可靠性ꎮ 利用野外采摘的成熟叶片、茎、正 ＰＣＲ 产物ꎬ在 １ ６００ ｂｐ 左右处可见一条明显的特
常萌发的实生苗幼苗以及干旱胁迫处理 ３ ｄ 后的 异性条带(图 １)ꎬ符合预期的目的基因片段大小ꎮ
处理组与对照组幼苗整体ꎬ提取总 ＲＮＡ 并反转录 测序结果表明ꎬＳａＧＰＡＴ１ 基因编码蛋白质的编码
成 ｃＤＮＡ 并以此为模板ꎬ以 ＮＧＤＣ 数据库中近缘物 序列区域为 １ ５９６ ｂｐꎬ编码 ５３２ 个氨基酸ꎬ并从中
种碱蓬( Ｓｕａｅｄａ ｇｌａｕｃａ) 的 Ｔｕｂｕｌｉｎ 为参考ꎬ选择蒿 发现 由 １０２ 个 氨 基 酸 残 基 组 成 的 酰 基 转 移 酶
叶猪毛菜的 ＳａＴｕｂｕｌｉｎ 作为内参基因ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ (ＰｌｓＣ)的保守序列(图 ２)ꎮ
５ 及 ＮＣＢＩ 在线引物设计网站设计 ＳａＧＰＡＴ１ 基因
的 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引 物 ( 表 １)ꎬ 使 用 ＳｕｐｅｒＲｅａｌ ＰｒｅＭｉｘ
Ｐｌｕｓ (ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ) 荧光定量预混试剂盒 [天根生
化科技( 北京) 有限公司] 进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲꎬ反应体
系为 ２０ μＬ:ｃＤＮＡ 模板 １ μＬ、上下游引物各 ０.６
￣１
μＬ(１０ μｍｏｌＬ )、２ × ＳｕｐｅｒＲｅａｌ Ｃｏｌｏｒ ＰｒｅＭｉｘ １０
μＬ、ｄｄＨ Ｏ ７.８ μＬꎮ 实时荧光定量反应程序为三
２
步法:９５ ℃ 预变性 １５ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 １０ ｓ、６０ ℃ 退
火 ２０ ｓ、７２ ℃ 延伸 ３２ ｓꎬ共 ４０ 个循环ꎮ 每组实验
Ｍ 为 ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｋｅｒꎻ 泳道 １ 和 ２ 为目的基因扩增产物
－ΔΔＣｔ 方 法 计 算
设置 ３ 个 生 物 学 重 复ꎬ 并 使 用 ２
条带ꎮ
ＳａＧＰＡＴ１ 基 因 的 相 对 表 达 量ꎮ 使 用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｍ ｉｓ ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｋｅｒꎻ ｌａｎｅｓ １ ａｎｄ ２ ａｒｅ ｂａｎｄｓ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ
Ｐｒｉｓｍ ８ 对实验结果进行分析并绘图ꎮ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ.
图 １ 蒿叶猪毛菜 ＳａＧＰＡＴ１ 基因的 ＰＣＲ 扩增
表 １ ＳａＧＰＡＴ１ 基因的扩增及 Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＳａＧＰＡＴ１ ｇｅｎｅ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 的引物序列 ｉｎ Ｓａｌｓｏｌａ ａｂｒｏｔａｎｏｉｄｅｓ
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ＳａＧＰＡＴ１ ｇｅｎｅ ２.２ ＳａＧＰＡＴ１ 基因的生物信息学分析
引物名称 引物序列(５′－３′) 引物功能 ２. ２. １ ＳａＧＰＡＴ１ 蛋 白 理 化 性 质 分 析 通 过
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) Ｐｒｉｍｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在线网站对蒿叶猪毛菜 ＳａＧＰＡＴ１ 蛋白
ＳａＴｕｂｕｌｉｎ￣Ｆ ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡ 内参基因
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ 进行分析ꎬ结果显示ꎬＳａＧＰＡＴ１ 蛋白质的分子式为
ＳａＴｕｂｕｌｉｎ￣Ｒ ＡＴＣＴＴＣＡＣＧＧＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣ 内参基因 Ｃ ２７７３ Ｈ ４３３４ Ｎ ７００ Ｏ ７５２ Ｓ ꎬ含有 ５３２ 个氨基酸ꎬ相对分子
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Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｅ
质量为 ６０ ４０８.８４ Ｄａꎬ理论等电点为 ８.５９ꎬ属于碱
ＳａＧＰＡＴ１￣Ｆ１ ＣＣＴＧＴＧＧＣＴＧＴＧＧＡＴＴＧＴＣＡ 实时荧光定量 ＰＣＲ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 性蛋白ꎮ 不稳定性指数为 ３６.２５ꎬ表明该蛋白具有
稳定性属于稳定蛋白ꎮ 亲脂系数为 ９８.８９ꎬ亲水性
ＳａＧＰＡＴ１￣Ｒ１ ＴＡＴＣＴＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＴＴＣＡＴ 实时荧光定量 ＰＣＲ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ
平均指数为 ０. １１９ ( 图 ３)ꎬ表明其属于疏水性蛋
ＳａＧＰＡＴ１￣Ｆ２ ＡＴＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＡＣＣＴＣＣＴＴＧ 基因扩增 白ꎮ 根据亚细胞定位预测结果ꎬＳａＧＰＡＴ１ 蛋白被
Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
定位于内质网ꎬ因此推测该蛋白主要在细胞质中
ＳａＧＰＡＴ１￣Ｒ２ ＴＴＡＣＣＧＧＣＣＡＡＡＡＴＣＡＡＧＴＡＣＴ 基因扩增
Ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
发挥作用ꎮ