Page 154 - 《广西植物》2025年第10期

１ ８ ８ ４ 广 西 植 物 ４５ 卷
隆、生物信息学分析和基因表达模式探讨ꎬ初步阐 ６.０ 软件确定基因扩增引物ꎬ引物序列如表 １ 所
述该基因在蒿叶猪毛菜应对干旱胁迫时的功能 示ꎮ 采用 Ｐ５１５ 酶(南京诺唯赞生物科技股份有限
表现ꎮ 公司)ꎬ以 ｃＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ＰＣＲ 反应
体系如下:２×Ｐ５１５ 酶 ２０ μＬꎬ上下游引物各 １ μＬꎬ
１ 材料与方法 模板 ３ μＬꎬｄｄＨ Ｏ 补足至 ４０ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增条件
２
设置如下:９４ ℃ ꎬ３ ｍｉｎꎻ９４ ℃ ꎬ３０ ｓꎻ６０ ℃ ３０ ｓꎻ７２
１.１ 材料 ℃ ꎬ１ ｍｉｎ ５０ ｓ( 每 ｋｂ １ ｍｉｎ)ꎻ３２ 个循环ꎮ 取 ５ μＬ
２０２２ 年 １０ 月于青海省德令哈市阿力腾寺院 ＰＣＲ 产物进行 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ使用胶回
(９７°２１′３６″ Ｅ、３７°２２′４８″ Ｎ) 采摘蒿叶猪毛菜成熟 收试剂盒 [ 生工生物工程( 上海) 股份有限公司]
叶片、茎及新鲜种子ꎮ 将采摘的成熟叶片和茎放 纯化目的片段ꎬ 随后采用克隆试剂盒 [ 生工生物
置液氮速冻后ꎬ－８０ ℃ 冰箱保存备用ꎻ采集的种子 工程(上海) 股 份 有 限 公 司] 将 回 收 产 物 连 接 至
于室外进行晾晒干燥处理ꎬ以获得后续实验所需 ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体后ꎬ转化至大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态
的原始材料ꎮ 细胞ꎬ在 ＬＢ 固体培养基( 含氨苄青霉素) 进行培
将晾晒干燥处理后的蒿叶猪毛菜种子置于无 养ꎬ后进行菌落阳性鉴定、质粒提取与测序验证ꎮ
菌水中 ４ ℃ 春化 ３６ ｈꎬ随后将种子浸泡在 ５％的次 １.２. ３ ＳａＧＰＡＴ１ 基 因 的 生 物 信 息 学 分 析 以
氯酸钠溶液中消毒处理 ５ ｍｉｎꎬ并用超纯水冲洗 ＳａＧＰＡＴ１ 蛋 白 序 列 进 行 ＢＬＡＳＴ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｂｌａｓｔ.
６ ~ ７ 次ꎮ 于超净台无菌环境下ꎬ将处理后的种子 ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｂｌａｓｔ. ｃｇｉ) 分 析ꎬ从 ＮＣＢＩ 下 载 各
接种到 ＭＳ 培养基中ꎬ并于培养室内培养ꎻ昼夜温 已知物种 ＧＰＡＴ 氨基酸序列ꎬ利用 ＣｌｕｓｔａｌＸ 进行多
度保持在 ２３ ℃ ꎬ湿度维持在 ５０％ꎬ光照与黑暗的 重序列比对ꎬ利用 ＭＥＧＡ ７ 软件以邻接法构建不
时间比为 １６ ｈ ∶ ８ ｈꎬ光照强度为 ６ ０００ ｌｘꎬ以此获 同植物 ＧＰＡＴ 蛋白的系统发育进化树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ 设
得蒿叶猪毛菜实生苗ꎮ 在生长 １ 周后ꎬ选取生长 置 为 １ ０００ꎻ 通 过 Ｅｘｐａｓｙ 网 站 的 在 线 工 具
状况一致的实生苗幼苗ꎬ转移至水培系统中ꎮ 因 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / 、
前期研究发现ꎬ１.５％ ＰＥＧ６０００ ＋ １ / ２ Ｈｏａｇｌａｎｄ 营 ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / ) 对 ＳａＧＰＡＴ１ 蛋
养液胁迫 ３ ｄ 后ꎬ能直观观察到幼苗在干旱胁迫下 白的理 化 性 质 和 亲 疏 水 性 进 行 预 测ꎻ利 用 Ｐｒａｂｉ
叶片出现萎蔫卷曲但不致死ꎬ故本次研究将部分 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ ＿
幼苗于 １ / ２ Ｈｏａｇｌａｎｄ 营养液中培养( ＣＫ)ꎬ其余幼 ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ％２０＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ) 和 ＳＷＩＳＳ￣
苗 移 至 用 １ / ２ Ｈｏａｇｌａｎｄ 营 养 液 配 制 的 处 理 液 ＭＯＤＥＬ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ)
(１.５％ ＰＥＧ６０００)中模拟干旱胁迫(处理组)ꎬ以上 对 ＳａＧＰＡＴ１ 蛋白进行二级结构和三级结构预测ꎻ
处理均 ３ 次重复ꎮ 在处理 ３ ｄ 后选取株高约 ４.５ 通 过 在 线 网 站 Ｐｌａｎｔ￣ｍＰＬｏｃ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｓｂｉｏ.
ｃｍ 且具有 ２ 片真叶的幼苗ꎬ进行取样ꎬ将所取幼苗 ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ / ｂｉｏｉｎｆ/ ｐｌａｎｔ￣ｍｕｌｔｉ/ )对 ＳａＧＰＡＴ１ 蛋白进
迅速放置液氮速冻后ꎬ－８０ ℃ 冰箱保存ꎬ部分幼苗 行亚 细 胞 定 位 预 测ꎻ 通 过 在 线 网 站 ＳｉｇｎａｌＰ￣６. ０
用于转录组测序ꎬ部分幼苗与野外采摘的成熟叶 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/

片和茎用于后续实时荧光定量 ＰＣＲ( ｑＲＴ￣ＰＣＲ) ＳｉｇｎａｌＰ￣６. ０ / ) 及 ＴＭＨＭＭ￣２. ０ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ.
实验ꎮ ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ￣２. ０ / ) 对
１.２ 方法 ＳａＧＰＡＴ１ 蛋白进行跨膜结构及信号肽的预测ꎮ

１.２.１ ＲＮＡ 提取及 ｃＤＮＡ 的合成 使用 ＲＮＡｐｒｅｐ １.２.４ ＳａＧＰＡＴ１ 基因启动子区顺式作用元件分析
Ｐｕｒｅ 多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒 [天根生化 基于蒿叶猪毛菜基因组及 ＧＦＦ 注释文件ꎬ利用

科技(北京) 有限公司] 提取蒿叶猪毛菜总 ＲＮＡꎬ ＴＢｔｏｏｌｓ 软件中 Ｇｔｆ/ Ｇｆｆ３ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ 功能提
用 ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ 合成试剂盒 [天根 取 ＳａＧＰＡＴ１ 基因上游 １.５ ｋｂ 序列作为启动子区

生化科技( 北 京) 有 限 公 司] 合 成 第 一 链 ｃＤＮＡꎬ 域ꎬ启 动 子 序 列 的 顺 式 作 用 元 件 由 在 线 工 具
－２０ ℃ 保存备用ꎮ ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( ｈｔｔｐ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ｐｓｂ. ｕｇｅｎｔ. ｂｅ /
１.２.２ ＳａＧＰＡＴ１ 基因的引物设计与克隆 根据蒿 ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ/ ) 预测ꎬ预测结果由 ＧＳＤＳ
叶猪毛菜 ＳａＧＰＡＴ１ 基因序列ꎬ采用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ 在线软件绘制ꎮ