Page 199 - 《广西植物》2025年第10期

１０ 期 黄金龙等: 马尾松 ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 基因生物信息学及表达分析 １ ９ ２ ９

基因进行同源蛋白序列查找ꎬ下载拟南芥、杨树等
物种的 ＷＲＫＹ 家族基因ꎬ利用 ＣｌｕｓｔａｌＷ 进行蛋白 ２ 结果与分析
序列 比 对ꎬ利 用 ＭＥＧＡ ７ 软 件 的 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ
(ＮＪ) 法构建系统进化树ꎬ其中选择 Ｐ￣ｄｉｓｔａｎｃｅ 模 ２.１ ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 基 因 生 物 信 息 学

型ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ 进行 １ ０００ 次重复ꎮ 分析
１.５ 实时荧光定量 ＰＣＲ (ＲＴ￣ｑＰＣＲ) ２.１.１ ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 基因理化性质分析
以 ＰｍＣＹＰ 基 因 为 内 参 基 因ꎬ 利 用 Ｐｒｉｍｅｒ 对 ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 蛋白分子质量、等
Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 软 件 设 计 ＰｍＷＲＫＹ２、 ＰｍＷＲＫＹ６ 和 电 点 和 疏 水 性 等 理 化 性 质 预 测 结 果 显 示ꎬ

ＰｍＣＹＰ 基因的实时 荧 光 定 量 ＰＣＲ 引 物 ( 表 １)ꎮ ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 蛋白分别编码 ６６７ 个和
参 照 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ⅱ 荧 光 试 剂 盒 ５７５ 个氨 基 酸ꎬ 蛋 白 分 子 量 分 别 为 ７２. ９７、６２. ６０

(ＴａＫａＲａ ꎬ大连)的说明书进行实时荧光定量 ＰＣＲ ｋＤａꎬ理论等电点分别为 ６.０２、６.６４ꎬ均属于酸性蛋
反应ꎬ 对 马 尾 松 ＰｍＷＲＫＹ２、 ＰｍＷＲＫＹ６ 和 ＰｍＣＹＰ 白ꎬ平均疏水值分别为－ ０.７９５、－ ０.６８４ꎬ不稳定系
基因在 ＡＢＡ、ＳＡ、ＭｅＪＡ 和 ＧＡ 等激素处理及相应 数分别为 ５０.７５、５１.０ꎬ均属于不稳定的疏水蛋白ꎻ
激素和钙离子共同处理下的表达量进行检测ꎬ每 亚细胞均定位于细胞核ꎬ没有跨膜结构ꎬ说明这两
－ΔΔＣＴ 个基因可能在细胞核内发挥其调控等作用ꎻ磷酸
个处理进行 ３ 次生物学重复ꎮ 用 ２ 法(Ｌｉｖａｋ ＆
Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎꎬ ２００１)进行目的基因相对表达量分析ꎬ 化位点分析结果显示这两个基因均存在丝氨酸、
利用 ＳＰＳＳ 软件进行方差分析ꎬ利用 Ｏｒｉｇｉｎ 软件进 苏氨酸和络氨酸磷酸位点ꎬ其中以丝氨酸位点最
行表达分析的柱状图绘制ꎮ 多ꎬ苏 氨 酸 次 之ꎬ ＰｍＷＲＫＹ２ 络 氨 酸 位 点 较 多ꎬ
ＰｍＷＲＫＹ６ 只有 １ 个ꎻ蛋白质二级结构预测显示ꎬ
表 １ 实时荧光定量 ＰＣＲ 引物序列设计 这两个 蛋 白 均 以 无 规 则 卷 曲 为 主ꎬ 占 比 分 别 为
Ｔａｂｌｅ １ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ＲＴ￣ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ７６.５０％、６０.２４％ꎬ ＰｍＷＲＫＹ２ 中 β 转角占比最小ꎬ
基因名 ＰｍＷＲＫＹ６ 中延伸链占比最小(表 ２)ꎮ
正向引物(５′－３′) 反向引物(５′－３′)
Ｇｅｎｅ
Ｆｏｒｗａｒｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) Ｒｅｖｅｒｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) ２.１.２ ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 系统进化与多序列
ｎａｍｅ
比 对 利 用 ＮＣＢＩ 的 ＢｌａｓｔＰ 工 具 分 别 查 找
ＰｍＷＲＫＹ２ ＧＧＴＴＣＡＧＧＡＴＧＡＴＧＣＴ ＡＧＴＧＣＣＡＧＴＣＧＴＴＧＴＴＧ
ＣＧＧＡＴＧＴＧ ＧＴＴＣＡＧ
ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 蛋白的同源氨基酸序列ꎬ
得 到 红 豆 杉 ( Ｔａｘｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ )、 日 本 柳 杉
ＰｍＷＲＫＹ６ ＣＡＣＣＡＴＧＴＣＡＣＣＧＴＧＣ ＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＧＴＧＧＡ
ＴＧＴＣＣ ＴＧＣＣ
( Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ )、 银 叶 五 针 松 ( Ｐｉｎｕｓ
ＰｍＣＹＰ ＧＧＣＡＡＡＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＴＡ ＧＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＡＴＧＡ
ｍｏｎｔｉｃｏｌａ) 等 １４ 个与 ＰｍＷＲＫＹ２ 蛋白同源性较高
ＡＧＣＴＣＴＧ
表 ２ ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 蛋白生物信息学分析
Ｔａｂｌｅ ２ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰｍＷＲＫＹ２ ａｎｄ ＰｍＷＲＫＹ６ ｐｒｏｔｅｉｎｓ
二级结构 磷酸化位点
氨基 蛋白 跨膜结构
核酸数 等电点 亚细胞 Ｓｅｃｏｎｄｅｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ (％) Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ
基因名 酸数 分子量 Ｔｒａｎｓ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｉｓｏｅｌｅｃ￣ 定位
Ｇｅｎｅ Ａｍｉｎｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｍ￣ 无规则
ａｃｉｄ ｔｒｉｃ Ｓｕｂｃｅｌｌｌａｒ 延伸链
ｎａｍｅ ａｃｉｄ ｍａｓｓ ｂｒａｎｅ α 螺旋 β 转角 卷曲 丝氨酸 苏氨酸 络氨酸
ｎｕｍｂｅｒ ｐｏｉｎｔ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ
ｎｕｍｂｅｒ (ｋＤａ) ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ α ｈｅｌｉｘ β ｔｕｒｎ Ｒａｎｄｏｍ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｙｒ
ｓｔｒａｎｄ
ｃｏｉｌ
ＰｍＷＲＫＹ２ ２ ００４ ６６７ ７２.９７ ６.０２ 细胞核 Ｎｕｃｌｅｕｓ 无 Ｎｏ ９.５８ ３.２９ １０.６３ ７６.５０ ６２ ２０ ５
ＰｍＷＲＫＹ６ １ ７２８ ５７５ ６２.６０ ６.６４ 细胞核 Ｎｕｃｌｅｕｓ 无 Ｎｏ ２８.３０ ８.６８ ２.７８ ６０.２４ ３９ １３ １
的序列ꎬ火炬松(Ｐ. ｔａｅｄａ)、挪威云杉( Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ) 植 物 聚 为 一 类ꎬ 亲 缘 关 系 较 其 他 物 种 近ꎬ
等 １５ 个与 ＰｍＷＲＫＹ６ 蛋白同源性较高的序列ꎬ进 ＰｍＷＲＫＹ２ 和 ＰｍＷＲＫＹ６ 均与油松的序列相似性
行蛋白多序列比对并构建系统进化树ꎮ 结果( 图 最高ꎬ分别为 ９３.００％和 ９９.８３％ꎮ 多序列比对结果
１)表明ꎬ马尾松与油松( Ｐｉｎｕｓ ｔａｂｕｌｉｆｏｒｍｉｓ) 等裸子 显示ꎬ在 ＰｍＷＲＫＹ２ 蛋白中ꎬ银杏、挪威云杉和火